陳青連，姚 振，萬 超

（杭州澳亞生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310018）

三唑類抗真菌藥物（如伏立康唑和泊沙康唑）抗真菌譜廣，抗菌效力強［1］，對念珠菌屬（包括耐氟康唑的克柔念珠菌、光滑念珠菌和白念珠菌耐藥株）具有抗菌作用，對所有檢測的曲菌屬真菌均有殺菌作用［2］，屬注射劑類制劑。為確保用藥安全，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定應(yīng)作無菌檢查，但由于此類藥物抗菌活性很強，因此，如何消除其抑菌性，使檢驗順利進(jìn)行，建立方法極重要，也較困難［3］。2015 年版《中國藥典（四部）》對無菌產(chǎn)品控制與國際標(biāo)準(zhǔn)趨于一致，實現(xiàn)了與國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）的要求統(tǒng)一協(xié)調(diào)［4］。同時，2015 年版《中國藥典》編制大綱強調(diào)，要加強藥品無菌檢查方法的建立與驗證方面的標(biāo)準(zhǔn)研究工作［5］。本研究中對抗真菌藥物制劑泊沙康唑注射液進(jìn)行了試驗研究，主要針對沖洗液、過濾膜材質(zhì)、流速、沖洗量、陽性對照菌的選擇及加入順序等全過程進(jìn)行考察，建立了三唑類抗真菌藥泊沙康唑注射液的無菌檢查方法，并進(jìn)行了方法適用性驗證?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ClassⅡType AIB3 型生化培養(yǎng)箱（廣東泰宏群科學(xué)儀器股份有限公司）；DGB330/DGB220 型一次性全封閉集菌培養(yǎng)器（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；HTY-2000B 型智能集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司）；KB115 E3-1 型低溫生化培養(yǎng)箱（德國賓得公司），GSP-9270MBE 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；XG1.DTE-0.6 型脈動真空干燥滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；尼龍膜（上海興亞凈化材料廠）；混合纖維素脂膜（上海興亞凈化材料廠）；PVDF 膜（上海半島實業(yè)有限公司凈化器材廠）。

1.2 試藥

泊沙康唑注射液（杭州澳亞生物技術(shù)有限公司，批號分別為19042311，19042511，19042611，規(guī)格為每支16.7 mL ∶300 mg）；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號為190429），0.9%無菌氯化鈉溶液（含0.1%聚山梨酯80，pH 3.8，批號為190305），均為杭州澳亞生物技術(shù)有限公司自制；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，批號為20190328）；無菌0.9%氯化鈉溶液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號為2A18090803）。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B）26 003］，銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa［CMCC（B）10 104］，大腸埃希菌Escherichia coli［CMCC（B）44 102］，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63 501］，生孢梭菌Clostridium sporogenes［CMCC（B）64 941］，白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98 001］，黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98 003］，均購自中國藥品生物制品檢定所菌種室，按2015 年版《中國藥典（四部）》附錄要求將以上7 種驗證菌配制成每1 mL 含菌數(shù)小于100 cfu 的菌懸液［6］。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備和培養(yǎng)基檢查

2.1.1 菌液制備

分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h。上述培養(yǎng)物用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL 含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培 養(yǎng) 基 上，20～25 ℃培 養(yǎng)5～7 d，加 入3～5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的無菌0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80 的無菌0.9%氯化鈉溶液制成1 mL 含孢子數(shù)小于100 cfu 的孢子懸液。

菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2 h 內(nèi)使用；若保存在2～8 ℃可在24 h 內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8 ℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。

2.1.2 培養(yǎng)基無菌性和靈敏度檢查

培養(yǎng)基無菌性檢查：取2 種培養(yǎng)基，各5 支，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30～35 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置20～25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，均培養(yǎng)14 d。結(jié)果無菌生長，即所用培養(yǎng)基無菌性檢查符合驗證要求。

培養(yǎng)基靈敏度檢查：取每管裝量為12 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7 支，分別接種小于100 cfu 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌各2 支。另1 支不接種，作為空白對照，培養(yǎng)3 d。取每管裝量為9 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7 支，分別接種小于100 cfu 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接種，作為空白對照，培養(yǎng)5 d。結(jié)果空白對照管無菌生長，接種菌液的培養(yǎng)基均生長良好，即所用培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合驗證要求。

2.2 無菌檢查方法建立

2.2.1 沖洗液選擇

取泊沙康唑注射液1 瓶，加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.1%無菌蛋白胨水溶液、0.9%氯化鈉注射液、無菌0.9%氯化鈉溶液（含0.1%聚山梨酯80，pH 3.8）和SBECD 溶液（pH 3.5）。5 種沖洗液各20 mL，觀察混合過程中的性狀變化，初步篩選可使用的沖洗液，結(jié)果pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，0.1%無菌蛋白胨水溶液，0.9%氯化鈉注射液均析出白色絮狀物；無菌0.9% 氯化鈉溶液（含0.1% 聚山梨酯80，pH 3.8），SBECD 溶液（pH 3.5）溶液澄清。

由于泊沙康唑注射液pH 為2.0～3.0，pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.1%無菌蛋白胨水溶液和0.9%氯化鈉注射液的pH 接近中性，采用該沖洗液進(jìn)行沖洗時會使泊沙康唑注射液樣品析出，導(dǎo)致析出物殘留在膜上，抑制微生物的生長。馬仕洪等［7］的報道指出，泊沙康唑注射液無菌檢查用稀釋液pH 的篩選，pH 在3.45～3.8 范圍內(nèi)微生物生長良好，故初步選擇pH 3.8的無菌0.9%氯化鈉溶液（含0.1%聚山梨酯80）和泊沙康唑注射液處方中的助溶劑輔料磺丁基倍他環(huán)糊精鈉（調(diào)節(jié)pH 至3.5～3.8）作為沖洗液進(jìn)行無菌檢查方法學(xué)適用性研究。

2.2.2 沖洗量選擇

預(yù)試驗方案1：供試品組中，取供試品20 支，每10 支稀釋至500 mL pH 3.8 的無菌0.9%氯化鈉溶液（含0.1%聚山梨酯80）中，先用約20 mL pH 3.8 的無菌0.9%氯化鈉溶液（含0.1%聚山梨酯80）潤濕集菌管，吸取供試品置集菌器中，過濾，每管先用900 mL pH 3.8 的無菌0.9%氯化鈉溶液（含0.1%聚山梨酯80）沖洗，分次沖洗，每次100 mL，再用無菌0.9% 氯化鈉注射液沖洗，每管的沖洗量為100 mL，分次沖洗，每次100 mL，試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的白色念珠菌、黑曲霉菌各1 mL，置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

預(yù)試驗方案2：供試品組中，取供試品20 支，每10 支稀釋至500 mL SBECD 溶液（pH 3.5）中，先用約20 mL SBECD 溶液（pH 3.5）潤濕集菌管，吸取供試品置集菌器中，過濾，每管先用300 mL SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗，分次沖洗，每次50 mL（每次需振蕩2 min），再用0.9%氯化鈉注射液沖洗，每管沖洗量為700 mL，分次沖洗，每次100 mL，然后在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的白色念珠菌、黑曲霉菌各1 mL，置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

預(yù)試驗方案3：供試品組中，取供試品20 支，每10 支稀釋至500 mL SBECD 溶液（pH 3.5）中，先用約20 mL SBECD 溶液（pH 3.5）潤濕集菌管，吸取供試品置集菌器中，過濾，每管先用500 mL SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗，分次沖洗，每次50 mL（每次需振蕩2 min），再用0.9%氯化鈉注射液沖洗，每管沖洗量為500 mL，分次沖洗，每次100mL，試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的白色念珠菌、黑曲霉菌各1 mL，置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

預(yù)試驗方案4：供試品組中，取供試品20 支，每10 支稀釋至500 mL SBECD 溶液（pH 3.5）中，先用約20 mL SBECD 溶液（pH 3.5）潤濕集菌管，吸取供試品置集菌器中，過濾，每管先用700 mL SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗，分次沖洗，每次50 mL（每次需振蕩2 min），再用0.9%氯化鈉注射液沖洗，每管沖洗量為300 mL，分次沖洗，每次100 mL，試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉菌）各1 mL，置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。陽性對照組中，另取濾管，不過濾供試液。分別向每個管中加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，作為陽性對照。試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉菌）各1 mL，將含培養(yǎng)基的容器置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。陰性對照組中，取相應(yīng)方案的稀釋劑、沖洗液，同法操作，然后加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，不加對照菌液，置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

結(jié)果分析：結(jié)果見表1。可見，方案1 采用無菌0.9%氯化鈉溶液（含0.1%聚山梨酯80，pH 3.8）作為沖洗液，白色念珠菌和黑曲霉菌均未生長；方案2 至方案4 采用不同梯度的SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗液進(jìn)行沖洗，結(jié)果顯示，SBECD 溶液（pH 3.5）用量越大，白色念珠菌和黑曲霉菌生長情況越好；方案4 為較優(yōu)選方案，但白色念珠菌在供試品中的長勢略弱于陽性對照組中菌的長勢，故繼續(xù)對該方法進(jìn)行優(yōu)化。

表1 沖洗量的選擇預(yù)試驗結(jié)果

2.2.3 過濾膜材質(zhì)選擇

1）高效液相色譜（HPLC）法

鑒于泊沙康唑注射液有強烈的抗真菌作用，無菌檢查時如何有效地沖洗掉濾膜上殘留的藥物，從而降低抗真菌活性十分關(guān)鍵。濾膜的成分、結(jié)構(gòu)和性能決定了其應(yīng)用范圍，在2.2.2 項下預(yù)試驗方案4 的基礎(chǔ)上，考察不同材質(zhì)濾膜對泊沙康唑注射液的吸附性差異，結(jié)果尼龍膜、混合纖維素脂膜和PVDF 膜過濾后膜上的樣品殘留量分別為0.035 7，0.003 5，0.117 5 mg/mL。故選擇殘留量較小的濾膜材質(zhì)進(jìn)行無菌檢查適用性試驗。

2）無菌檢查方法學(xué)適用性預(yù)試驗

同步取混合纖維素脂膜、尼龍膜和PVDF 膜材質(zhì)的集菌器進(jìn)行無菌檢查方法學(xué)適用性預(yù)試驗。

供試品組：取供試品20 支，每10 支稀釋至500 mL SBECD 溶液（pH 3.5）中，先用約20 mL SBECD 溶液（pH 3.5）潤濕集菌管，吸取供試品置集菌器（混合纖維素脂膜、尼龍膜和PVDF 膜）中，過濾，每管先用700 mL SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗，分次沖洗，每次50 mL，再用0.9%氯化鈉注射液沖洗，每管沖洗量為300 mL，分次沖洗，每次100 mL。試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉菌）各1 mL，置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

陽性對照組：另取濾管，不過濾供試液。然后分別向每個管中加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，作為陽性對照。試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉菌）各1 mL，將含培養(yǎng)基的容器置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

陰性對照組：取稀釋劑、沖洗液，同法操作，然后加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，不加對照菌液，置20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

3）結(jié)果分析

結(jié)果見表2。可見，不同材質(zhì)的濾膜對泊沙康唑的吸附程度不一致，其中以混合纖維素脂膜材質(zhì)的濾膜吸附最小，且通過無菌檢查方法學(xué)適用性驗證預(yù)試驗確認(rèn)，采用混合纖維素脂膜的結(jié)果最優(yōu)，因此，選用混合纖維素脂膜材質(zhì)的薄膜過濾器進(jìn)行正式的方法學(xué)適用性驗證。

表2 3 種不同材質(zhì)濾膜對泊沙康唑注射液方法學(xué)適用性預(yù)試驗結(jié)果

2.3 無菌檢查方法適用性驗證

2.3.1 驗證方法

供試品陽性對照組（PPC）：取3 批供試品，每批60 瓶，每10 瓶供試品稀釋至500 mL SBECD 溶液（pH 3.5）中，每10 瓶供試品接種于1 個集菌管；先用約20 mL SBECD溶液（pH 3.5）潤濕濾筒，再吸取供試品置集菌器中，每管用SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗，沖洗量為700 mL，分次沖洗，每次100 mL，再用0.9%氯化鈉注射液沖洗，每管沖洗量300 mL，分次沖洗，每次100 mL。然后分別向每個管中加入相應(yīng)培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌的3 管加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，培養(yǎng)真菌的3 管加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）100 mL。試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的試驗菌各1 mL（硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭菌，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉），置規(guī)定溫度（30～35 ℃、20～25 ℃）培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

陽性對照組（PC）：另取濾管，不過濾供試液。然后分別向每個管中加入相應(yīng)培養(yǎng)基，作為陽性對照。試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100cfu/mL 的試驗菌各1 mL，將含培養(yǎng)基的容器置規(guī)定溫度（30～35 ℃、20～25 ℃）培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

陰性對照組：另取濾管，不過濾供試液，每管先用SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗，沖洗量為700 mL，分次沖洗，每次100 mL，再用0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行沖洗，每管沖洗量為300 mL，分次沖洗，每次100 mL。然后分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各100 mL，不加對照菌液，將含培養(yǎng)基的容器置規(guī)定溫度（30～35 ℃、20～25 ℃）培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為不超過5 d。

沖洗液陽性對照組（PPC）：另取濾管，不過濾供試液，每管先用SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗，沖洗量為700mL，分次沖洗，每次100 mL，再用0.9%氯化鈉注射液沖洗，每管沖洗量為300 mL，分次沖洗，每次100 mL。然后分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各100 mL，作為沖洗液陽性對照組。試驗完成后，在生物安全柜里，往每個濾管加入小于100 cfu/mL 的試驗菌各1 mL，將含培養(yǎng)基的容器置規(guī)定溫度（30～35 ℃、20～25 ℃）培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不超過5 d。

2.3.2 結(jié)果分析

根據(jù)3 批泊沙康唑注射液和沖洗液方法學(xué)適用性試驗結(jié)果，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌與黑曲霉供試品與陽性對照組中菌的長勢一致。結(jié)果見表3 和表4。取3 批供試品，每批60 瓶，每10 瓶供試品稀釋至500 mL SBECD 溶液（pH 3.5）中，每10 瓶供試品接種于1 個集菌管；先用約20 mL SBECD 溶液（pH 3.5）潤濕濾筒，再吸取供試品置集菌器中，每管用SBECD 溶液（pH 3.5）沖洗，沖洗量為700 mL，分次沖洗，每次100 mL，再用0.9%氯化鈉注射液沖洗，每管沖洗量為300 mL，分次沖洗，每次100 mL。然后分別向每個管中加入相應(yīng)培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌的3 管加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，培養(yǎng)真菌的3 管加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）100 mL。根據(jù)檢查結(jié)果，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌與黑曲霉供試品與陽性對照中菌的長勢一致，故本品可采用該方法進(jìn)行無菌檢查。

表3 3 批泊沙康唑注射液無菌檢查方法適用性試驗檢查結(jié)果

表4 沖洗液無菌檢查方法適用性試驗檢查結(jié)果

2.4 無菌檢查結(jié)果

根據(jù)2.2.4 項下的驗證方法，按2015 年版《中國藥典（四部）》通則1101 無菌檢查法薄膜過濾法對泊沙康唑注射液3 批樣品進(jìn)行檢測，培養(yǎng)14 d，均無菌生長，產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，三唑類抗真菌藥對真菌有很強的抑菌作用，對于這類具有較強抗菌活性的藥物必須首先摸索處理方式來消除其抑菌作用，然后才能順利進(jìn)行無菌檢查［8］，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究中采用薄膜過濾法，對沖洗液、沖洗量、濾膜的材質(zhì)、沖洗條件等進(jìn)行了篩選和優(yōu)化［9-10］，在研究過程中還考慮了樣品的過濾速度和沖洗速度對沖洗效果的影響。以自制的SBECD 溶液（pH 3.5）作為沖洗液進(jìn)行沖洗，考慮其pH 與樣品本身的pH 相近，防止樣品的析出殘留在濾膜上增加抑菌性［11］，同時對沖洗液同步進(jìn)行方法學(xué)適用性驗證，確保沖洗液本身無抑菌性［12］。

在進(jìn)行泊沙康唑注射液無菌檢查方法學(xué)適用性預(yù)試驗時，以2015 年版《中國藥典（四部）》規(guī)定的6 種無菌檢查試驗菌株是否能正常生長為指標(biāo)，通過一系列的篩選和優(yōu)化，最終建立了適合泊沙康唑注射液無菌檢查的方法。在驗證無菌檢查方法時，選擇敏感菌株白色念珠菌作為陽性菌［13］。通過方法學(xué)適用性驗證試驗證明，該方法可行、結(jié)果可靠，同時給其他三唑類產(chǎn)品的無菌檢查提供了參考。