高云飛，王文重,2*，宿飛飛，閔凡祥，劉振宇，魏 琪，萬書明

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，黑龍江 哈爾濱150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱150086）

馬鈴薯干腐病是由鐮孢菌屬（Fusariumspp.）引起的一種世界性范圍的真菌病害，也是窖貯期間馬鈴薯主要病害之一。在窖藏過程中，由干腐病造成的損失率一般為10%～35%，嚴重時高達60%[1-4]，給馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[5]。由于馬鈴薯沒有抗鐮刀菌干腐病品種，因此只能通過化學(xué)藥劑進行防控，但長期大量施用化學(xué)藥劑易造成嚴重的環(huán)境污染，還會導(dǎo)致鐮孢菌產(chǎn)生抗藥性，防治效果逐年降低。閔凡祥等[6]和李鳳蘭等[7]都曾報道，從有典型馬鈴薯干腐病癥狀的薯塊中成功分離得到接骨木鐮孢菌（F.sambucinum）、燕麥鐮孢菌（F.avenaceum）和茄病鐮孢菌藍色變種（F.solamivar.coeruleum），其致病率分別為87.5%、70.2%和40.25%；黃色鐮刀菌（F.culmorum）和燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）對離體塊莖的致病率分別為41.05%和72.20%。目前，利用植物源殺菌藥防治馬鈴薯干腐病鐮孢菌已成為研究熱點，對鐮孢菌的研究已有一些報道。王靜等[8]的研究表明，丹參、半夏、仙人掌等藥用植物的丙酮粗提物對串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）有一定的抑制效果。但關(guān)于蕨類植物對鐮孢菌抑制作用的研究尚且不多。粗莖麟毛蕨（Dryopteris crassirhizoma）為鱗毛蕨科鱗毛蕨，屬多年生草本植物，是中國藥典收載的中藥材貫眾的原植物，主要分布于東北和河北的東北部地區(qū)[9]。粗莖鱗毛蕨的干燥根莖又稱為綿馬貫眾，綿馬貫眾含有多種間苯三酚類化合物、黃酮類化合物和萜類化合物[10-12]?，F(xiàn)已知間苯三酚單體成分為綿馬酸ABA、綿馬貫眾素ABBA和白綿馬素AA[13,14]。研究表明，綿馬貫眾煎劑能有效的抑制傷寒桿菌（Salmonella enterica）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。間苯三酚衍生物能抑制乳酸桿菌（Lactobacillus）生長[15]，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌有一定抑菌作用[16]。因此開發(fā)高效、低毒植物源殺菌藥是防治馬鈴薯干腐病的有效措施。

本研究通過生長速率法測定粗莖鱗毛蕨提取物綿馬貫眾素ABBA對馬鈴薯干腐病鐮孢菌的抑制效果，進一步研究綿馬貫眾素ABBA對接骨木鐮孢菌菌絲和孢子萌發(fā)抑制作用，為合理研發(fā)植物源農(nóng)藥提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

黃色鐮孢菌、接骨木鐮孢菌、燕麥鐮孢菌、茄病鐮孢菌藍色變種。均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所提供。

1.1.2 植物材料

粗莖鱗毛蕨植株于2012年8月采自黑龍江省帽兒山，采收植物材料陰干后粉碎，過40目篩備用。粗莖鱗毛蕨植株標本保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物教研室。

1.1.3 主要試劑

綿馬貫眾素ABBA標準品（HPLC≥95%）購買于上海源葉生物科技有限公司；甲醇為美國DIKMA公司的色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器

Waters 600型高效液相色譜儀（美國沃特世），Waters 2847型紫外檢測器（美國沃特世），Waters 2707自動進樣器（美國沃特世）；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪予華儀器廠）；KQ2200B型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市舒美超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)計了雙因素完全隨機試驗，3次重復(fù)。其中因素A為濃度，分別為0.5和1 mg/mL；因素B為菌種，分別為黃色鐮孢菌，燕麥鐮孢菌，接骨木鐮孢菌和茄病鐮孢菌藍色變種。試驗在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所實驗室完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗莖鱗毛蕨中綿馬貫眾素ABBA提取

稱取500 g粗莖鱗毛蕨粉末，按料液比1∶10加入到80%的乙醇溶液中，避光冷浸24 h，在功率800 W 30℃的超聲波下浸提2次，30 min。浸提液以5 000 r/min離心，取上清，真空抽濾，合并濾液。用正己烷以1∶1萃取濾液，混勻靜置，取上層液體，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至膏。用15%乙醇以10倍量對浸膏進行溶解，用酸堿調(diào)至中性。DM-130大孔樹脂預(yù)處理[17]后將上述的液體樣品加入到經(jīng)處理過的DM-130大孔吸附樹脂吸附柱內(nèi)，先用蒸餾水洗，再分別經(jīng)過30%和50%甲醇清洗，棄濾液，用90%甲醇洗脫吸附柱，濾液為含有綿馬貫眾素ABBA成分的藥液，備用。

1.3.2 HPLC法綿馬貫眾素ABBA的含量測定

精確稱量10 mg綿馬貫眾素ABBA標準品，用甲醇定容為25 mL。再精密吸取1，2，3，4和5 mL，用甲醇定容100 mL，得到質(zhì)量濃度分別4，8，12，16和20 ng/μL的綿馬貫眾素ABBA標準溶液。色譜條件參考金哲[18]和肖國君等[19]略有修改。色譜柱：Waters 600 C18柱（250 mm×4.6 mm，10μm）；流動相：甲醇-0.5 %磷酸水95%～100%甲醇梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：20℃；檢測波長300 nm。定量測定方法采用外標法。配置不同濃度的提取液。

1.3.3 綿馬貫眾素ABBA提取液對鐮孢菌抑菌活性測定

提取液對鐮孢菌的影響采用生長速率法[20]，在配制不同濃度植物提取液時，采用超聲波法助溶[21]。一切操作均在無菌條件下進行，取9 mL上述植物提取液加入PDA培養(yǎng)基中，混勻，以等量無菌水為對照。將經(jīng)活化的供試鐮刀菌接種到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取生長狀況一致的供試菌餅（Ф=6.0 mm），將有菌絲的一面貼在PDA培養(yǎng)基表面上，25℃培養(yǎng)，等對照組菌落直徑占培養(yǎng)基2/3時，采用十字交叉法測量，計算的菌落生長量，每個處理重復(fù)3次。按照下列公式計算抑制率：

純生長量=菌落平均直徑-菌餅直徑

抑制率（%）=（對照菌落純生長量-處理菌落純生長量）/對照菌落純生長量×100

1.3.4 綿馬貫眾素ABBA提取液對接骨木鐮孢菌孢子萌發(fā)率的測定

取25℃培養(yǎng)7 d含有接骨木鐮孢菌的培養(yǎng)皿，加入少量無菌水，將其上的菌絲刮下，轉(zhuǎn)入已滅菌的三角瓶中，振蕩、過濾，最后通過血球計數(shù)板將孢子濃度稀釋到1×105cfu/mL備用。

取等量的不同濃度的綿馬貫眾素ABBA溶液、無菌水、上述孢子菌液和PD液體培養(yǎng)基，加入無菌離心管中，混合均勻，25℃培養(yǎng)。每1 h鏡檢記錄1次孢子萌發(fā)數(shù)，共調(diào)查5次，每次鏡檢200個孢子，每個處理3次重復(fù)。

孢子萌發(fā)率（%）=孢子萌發(fā)數(shù)/調(diào)查孢子總數(shù)×100

1.3.5 綿馬貫眾素ABBA提取液對接骨木鐮孢菌菌絲干重的測定

在50 mL PD液體培養(yǎng)基中接種接骨木鐮孢菌的菌餅（Ф=6 mm）5片，按體積比2%接種量分別接種0.1和0.5 mg/mL的綿馬貫眾素ABBA，加入等量的無菌水作為對照組。25℃100 r/min振蕩，培養(yǎng)15 d，用紗布過濾收集菌絲，烘干并稱重，每個處理3次重復(fù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010和DPS 15.10完成。采用完全隨機雙因素有重復(fù)方差分析方法，多重比較采用最小顯著差數(shù)法（Least Significant Different）。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿馬貫眾素ABBA提取液含量測定

綿馬貫眾素ABBA標準品的保留時間在7 min左右（圖1），表明綿馬貫眾素ABBA標準品對應(yīng)色譜峰的紫外吸收光譜有良好的分離效果，能夠用來分離樣品中的綿馬貫眾素ABBA。綿馬貫眾素ABBA含量測定標準曲線Y=0.052 8X-0.159 1（其中Y為綿馬貫眾素ABBA標準品含量（ng），X為綿馬貫眾素ABBA標準品峰面積（mAU*s），R2=0.999 9。樣品中綿馬貫眾素ABBA提取液濃度為15.30 mg/mL。

2.2 綿馬貫眾素ABBA提取液對鐮孢菌的抑制率的影響

綿馬貫眾素ABBA的不同濃度提取液對鐮孢菌的抑菌作用差異顯著（表1）。當綿馬貫眾素ABBA濃度為0.5 mg/mL時，其對鐮孢菌的平均抑菌率為71.19%，當濃度提高的1.0 mg/mL時，相應(yīng)的平均抑菌率提高到91.49%。不同鐮孢菌對綿馬貫眾素ABBA的敏感性有顯著差異（表1），其中以接骨木鐮孢菌對綿馬貫眾素ABBA敏感性最高，平均抑菌率為88.82%，其次為黃色鐮孢菌，平均抑菌率為82%，茄病鐮孢菌藍色變種敏感性最低，平均抑菌率為73.98%。

表1 不同濃度綿馬貫眾素ABBA和鐮孢菌雙因素方差分析Table 1 Two-factor analysis of variance of Fusarium spp.and different concentrations

方差分析（表1）亦表明，濃度×鐮孢菌互作顯著。當粗莖鱗毛蕨綿馬貫眾素ABBA提取液濃度在0.5 mg/mL水平時，對接骨木鐮孢菌的抑制率顯著高于另外3種鐮孢菌抑制率，對黃色鐮孢菌和燕麥鐮孢菌的抑制率顯著高于茄病鐮孢菌藍色變種抑制率，抑制率均在61%以上，其中對接骨木鐮刀菌的抑制率最高，高達82.4%，對茄病鐮孢菌藍色變種的抑制率最低，為61.5%（圖2A）；在1 mg/mL時，抑制率均在86%以上，其中對接骨木鐮刀菌的抑制率最高，高達95.2%，對茄病鐮孢菌藍色變種的抑制率最低，為86.4%（圖2B）。由此可見，粗莖鱗毛蕨綿馬貫眾素ABBA對不同種鐮刀菌有良好的抑制效果，且高濃度的抑菌效果顯著高于低濃度的抑菌效果。

2.3 綿馬貫眾素ABBA提取液對接骨木鐮孢菌孢子萌發(fā)率的影響

綿馬貫眾素ABBA溶液處理接骨木鐮孢菌的孢子，孢子萌發(fā)受到一定抑制，處理組孢子萌發(fā)率顯著低于無菌水處理的空白對照（圖3）。在綿馬貫眾素ABBA處理5 h時，0.1和0.5 mg/mL水平的處理組接骨木鐮孢菌的孢子萌發(fā)率分別為26.97%和5.48%，而此時對照組孢子萌發(fā)率為55.33%，對照組孢子萌發(fā)率是0.1 mg/mL濃度處理組孢子萌發(fā)率2倍多，是0.5 mg/mL濃度處理組孢子萌發(fā)率10倍多。0.1 mg/mL的綿馬貫眾素ABBA溶液不能完全抑制孢子萌發(fā)，而0.5 mg/mL可以有效的抑制孢子萌發(fā)，為5%以下。0.1和0.5 mg/mL的處理組顯示，隨著處理時間的延長，孢子萌發(fā)率不斷增加，但增加幅度小，0.1和0.5 mg/mL的處理組在0～3 h與對照組相比，抑制孢子萌發(fā)的效果顯著，3 h時與對照組相比，孢子萌發(fā)率均低于10.0%，此時空白對照組孢子萌發(fā)率已達到24.1%。因此，0.1 mg/mL綿馬貫眾素ABBA溶液可在一定程度上延緩接骨木鐮孢菌孢子的萌發(fā)，而0.5 mg/mL綿馬貫眾素ABBA溶液可有效抑制其孢子的萌發(fā)。

2.4 綿馬貫眾素ABBA提取液對接骨木鐮孢菌菌絲干重的影響

綿馬貫眾素ABBA溶液處理可以顯著抑制接骨木鐮孢菌菌絲的生長（圖4）。隨著處理濃度的遞增，菌絲干重降低，且均顯著低于空白對照。當綿馬貫眾素ABBA濃度為0.1 mg/mL時，菌絲體干重為對照的67.23%，當0.5 mg/mL時，僅為對照的31.09%。綿馬貫眾素ABBA是四環(huán)間苯三酚屬多環(huán)間苯三酚，其含有2個乙?；?個丁酰基，可能綿馬貫眾素ABBA作用于鐮孢菌細胞壁引起組分的變化，進而使其細胞內(nèi)容物有滲漏，使細胞消融，從而導(dǎo)致菌絲干重的降低。

3 討論

多種植物提取物具有抑制鐮孢菌的效果，潘翠翠等[22]發(fā)現(xiàn)甘草提取物對尖孢鐮刀菌有一定抑制效果。李孫洋等[23]認為三叉苦（Euodia lepta）對腐皮鐮刀菌（F.solan）的菌絲生長有一定抑制作用，但蕨類植物對鐮孢菌抑制作用研究鮮有報道。

鱗毛蕨屬植物在全球有450多種植物，其中在中國約有300多種，而有藥用價值有20多種，粗莖鱗毛蕨是其中的一種，粗莖鱗毛蕨含有多種化學(xué)成分，這些成分具有多方面的藥理作用。研究顯示其主效成分主要是間苯三酚類化合物，目前已分離間苯三酚類化合物有80多種[24,25]。本文首次將粗莖鱗毛蕨中綿馬貫眾素ABBA應(yīng)用到馬鈴薯干腐病防治方面，為研發(fā)新高效植物源殺菌劑提供了理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，在一定程度上粗莖鱗毛蕨中綿馬貫眾素ABBA對茄腐病鐮孢菌藍色變種、接骨木鐮孢菌、燕麥鐮孢菌和黃色鐮孢菌起到一定抑制作用。在綿馬貫眾素ABBA同一濃度下，對接骨木鐮孢菌抑制率顯著優(yōu)于其他3種鐮孢菌，同時證明其對綿馬貫眾素ABBA相對敏感。同時據(jù)不同國家報道的病原菌的優(yōu)勢種在不同地方有所不同，但報道接骨木鐮刀菌為主要病原菌的文獻較多[26-28]，同時也是黑龍江省馬鈴薯干腐病主要致病菌之一。因此，本研究對接骨木鐮孢菌進行了孢子萌發(fā)和菌絲干重的初步研究，結(jié)果表明孢子萌發(fā)隨時間的延長，孢子萌發(fā)率緩慢的上升；菌絲干重隨綿馬貫眾素ABBA溶液濃度的升高而降低。馬貫眾素ABBA溶液對接骨木鐮孢菌的抑菌機理，還需要后續(xù)通過電導(dǎo)率變化、內(nèi)容物的滲漏情況、菌體細胞壁組分變化等方面具體研究。本研究結(jié)果顯示，粗莖鱗毛蕨中綿馬貫眾素ABBA對4種鐮孢菌的抑制率有顯著差異，并證明粗莖鱗毛蕨具有開發(fā)植物源殺菌劑的潛力，為防治馬鈴薯干腐病植物源殺菌劑的研發(fā)提供更科學(xué)和具體的理論基礎(chǔ)。