鄔佳玲,魏 亮,祝貞科,葛體達(dá),吳金水,毛 瑢

(1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，鄱陽湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)國家林業(yè)和草業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.中國科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410125；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

0 引 言

土壤酶是指凋落物分解、土壤微生物代謝以及植物根系所產(chǎn)生的胞內(nèi)酶和胞外酶的總和，其中胞內(nèi)酶主要存在于微生物體內(nèi)，而胞外酶通常游離在土壤溶液中或被土壤顆粒表面所吸附[1-2]。土壤酶是土壤生物化學(xué)過程的催化劑，控制著土壤有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)和形成過程。其中，β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)和纖維二糖水解酶(CBH)調(diào)控著纖維素和其他β-1,4-葡聚糖的降解過程，是表征土壤碳(C)周轉(zhuǎn)過程的敏感指標(biāo)；β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)決定著幾丁質(zhì)和氨基葡萄糖聚合物的降解過程，可有效地指示土壤氮素有效性；酸性磷酸酶(AP)能將磷酸單酯和磷酸二酯水解成磷酸鹽，決定著土壤有機(jī)磷的礦化速率[3-5]。由此可見，土壤酶活性與土壤有機(jī)質(zhì)含量和養(yǎng)分狀況等密切相關(guān)，是土壤肥力高低和微生物代謝活性的重要標(biāo)志[6-8]。因此，土壤酶在調(diào)控土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)、維持土壤肥力和實(shí)現(xiàn)農(nóng)田可持續(xù)經(jīng)營中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[7,9]。

土壤酶活性受土壤有機(jī)質(zhì)含量及底物可利用性的影響，而且土壤C底物與養(yǎng)分之間的化學(xué)計(jì)量特征能改變微生物生長和代謝過程中的能量和養(yǎng)分分配格局，進(jìn)而影響土壤酶活性之間的化學(xué)計(jì)量比例[10]。Sinsabaugh等[7,11]發(fā)現(xiàn)參與土壤C循環(huán)的BG和CBH酶活性均與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。已有研究也發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥輸入提高了BG活性，增加了土壤微生物對(duì)有機(jī)碳的分解利用過程，這進(jìn)一步為土壤微生物提供了豐富的底物，促進(jìn)了土壤有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)[12-13]。相對(duì)于氮(N)和磷(P)等大量營養(yǎng)元素，農(nóng)田土壤缺硫(S)的現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，已成為提高作物產(chǎn)量的關(guān)鍵影響因素之一[14-15]。因此，含硫化肥的大量施用，在緩解作物缺硫的同時(shí)，也可能會(huì)改變土壤酶活性，但由于相關(guān)的研究極少，土壤硫有效性變化對(duì)酶活性的影響仍然不清楚。湯珍珠[16]的研究指出，同時(shí)添加葡萄糖和N、P、S等營養(yǎng)元素能緩解土壤微生物代謝的養(yǎng)分限制，導(dǎo)致土壤BG和NAG活性不斷降低。生態(tài)化學(xué)計(jì)量學(xué)理論認(rèn)為，土壤微生物元素組成具有相對(duì)穩(wěn)定的比例，當(dāng)土壤中底物的化學(xué)計(jì)量比無法滿足微生物生長需求時(shí)，微生物能調(diào)整胞外酶的分配格局，從土壤有機(jī)質(zhì)中獲取其生長過程中所缺乏的能量或養(yǎng)分，進(jìn)而維持自身的化學(xué)計(jì)量內(nèi)穩(wěn)性[2]。因此，研究土壤酶活性對(duì)C和營養(yǎng)元素狀況變化的響應(yīng)方式及其化學(xué)計(jì)量學(xué)特征，有助于認(rèn)知和理解土壤酶在調(diào)控土壤物質(zhì)循環(huán)和維持土壤肥力中的重要作用。

我國是全球水稻的主產(chǎn)國，稻田面積約占全球的15%，提高稻田土壤肥力對(duì)增加糧食產(chǎn)量、保障我國糧食安全具有十分重要的戰(zhàn)略意義[17]。近幾十年以來，為了提高稻田土壤肥力和生產(chǎn)力，稻田土壤所施加的有機(jī)物料和化學(xué)肥料等呈大幅度增長趨勢[18]。有機(jī)物料和化學(xué)肥料的高強(qiáng)度投入改變土壤原有C和養(yǎng)分含量及其計(jì)量比，這可能會(huì)影響參與土壤C和養(yǎng)分循環(huán)的酶活性[19-21]，進(jìn)而改變土壤肥力和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)生產(chǎn)能力。為此，本研究以亞熱帶地區(qū)典型稻田土壤作為研究對(duì)象，基于不同生態(tài)化學(xué)計(jì)量比的C和養(yǎng)分添加試驗(yàn)，揭示參與C、N、P轉(zhuǎn)化的土壤酶活性的響應(yīng)特征，并探討其與土壤元素計(jì)量比之間的關(guān)系，研究結(jié)果對(duì)理解稻田生態(tài)系統(tǒng)C循環(huán)過程、加強(qiáng)稻田土壤養(yǎng)分管理等具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土壤樣品采自湖南省瀏陽市北部的北盛鎮(zhèn)(113°10′24″～114°10′26″E，28°52′43″～28°52′46″N)長期種植水稻的稻田生態(tài)系統(tǒng)。研究區(qū)屬于中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年平均氣溫為16.3 ℃，年均日照時(shí)間為1 519 h，年均降雨量為1 430 mm。研究區(qū)土壤屬于第四紀(jì)紅土母質(zhì)發(fā)育紅壤。用不銹鋼土鉆(直徑5 cm)采集0～20 cm耕作層土壤，手工去除可見的植物殘?bào)w、石塊以及大型土壤動(dòng)物等，將其分為三部分。一部分放置于室內(nèi)陰涼處風(fēng)干，過2 mm篩用于測定土壤pH、速效磷和有效硫，第二部分風(fēng)干后粉碎過0.149 mm篩，用于測定土壤有機(jī)碳、全氮和全磷，第三部分土樣過2 mm篩，用于微生物生物量碳測定和土壤培養(yǎng)試驗(yàn)。供試土壤基本屬性見表1。

表1 稻田土壤基本屬性Table 1 Basic properties of paddy soil

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本次室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)采用葡萄糖作為外加C源，添加的葡萄糖-C量相當(dāng)于土壤中50%的微生物生物量C，而N、P、S等營養(yǎng)元素的添加量則根據(jù)土壤微生物生長對(duì)C和養(yǎng)分需求的生態(tài)化學(xué)計(jì)量比來進(jìn)行設(shè)定[22]。土壤微生物的C利用效率(CUE)，即在分解土壤有機(jī)質(zhì)過程中，微生物自身生物量生長所同化的有機(jī)碳量占其所吸收的有機(jī)碳總量的比例[11]。由于微生物C利用效率通常會(huì)受到養(yǎng)分元素比值的影響，本研究根據(jù)Sinsabaugh等[11]提出的理論模型，設(shè)置了微生物C利用效率梯度，按照添加的葡萄糖中C量計(jì)算不同梯度所需要的N、P和S添加水平，從生態(tài)化學(xué)計(jì)量學(xué)的角度評(píng)估養(yǎng)分添加量對(duì)土壤微生物C利用效率的影響及其調(diào)控機(jī)理。本研究根據(jù)土壤微生物C利用效率(0、0.1、0.3、0.5和0.6)和養(yǎng)分需求的化學(xué)計(jì)量比計(jì)算出N、P、S元素的添加量(表2)，選取一組土壤樣品同時(shí)添加葡萄糖和養(yǎng)分元素(GN0,GN1,GN2,GN3和GN4)共5個(gè)處理，同時(shí)選取另一組土壤樣品只添加養(yǎng)分元素(N0,N1,N2,N3和N4)共5個(gè)處理，合計(jì)10個(gè)處理。對(duì)于每個(gè)處理，稱取過2 mm篩的20 g土壤樣品(烘干土樣計(jì))于500 ml培養(yǎng)瓶中，將葡萄糖、NH4Cl、KH2PO4和Ca2SO4以溶液的形式加入到土壤中，添加去離子水到淹沒土壤樣品2～3 cm，將培養(yǎng)瓶密封并充入氮?dú)鉀_洗至厭氧狀況，然后將培養(yǎng)瓶放入25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)2次采樣時(shí)間(3 d和60 d)，因此，每個(gè)C和養(yǎng)分添加處理設(shè)置8個(gè)重復(fù)，共計(jì)80個(gè)厭氧培養(yǎng)瓶。

表2 不同試驗(yàn)處理每100 mg葡萄糖-碳對(duì)應(yīng)的氮、磷、硫添加量及其化學(xué)計(jì)量比Table 2 The amounts and stoichiometric ratios of carbon,nitrogen,phosphorus,and sulfur per 100 mg of glucose-C under different treatments

1.3 測定方法

采用破壞性取樣法，在培養(yǎng)的第3 d和60 d分別采集40個(gè)培養(yǎng)瓶中的所有土壤樣品，將土壤樣品冷凍干燥后用于測定土壤胞外酶活性。本研究在激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長450 nm的條件下，在多功能酶標(biāo)儀(Fluoroskan Ascent FL,Thermo Scientific,USA)上采用熒光分析法測定BG、CBH、NAG和AP4種胞外酶活性，采用米氏方程擬合得到土壤酶的最大活性潛勢(Vmax)，以每小時(shí)每克樣品的基質(zhì)轉(zhuǎn)化率(nmol·g-1·h-1)表示土壤酶活性[23]。C、N、P水解酶之間的計(jì)量比計(jì)算過程中，以(BG+CBH)作為碳水解酶活性的總和，NAG代表氮水解酶活性，AP代表酸性磷水解酶活性，因此碳和氮水解酶活性比值為[(BG+CBH)/NAG]，碳和磷水解酶活性比值為[(BG+CBH)/AP]。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)首先采用Microsoft Excel進(jìn)行處理，然后在SPSS 18.0軟件包中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析對(duì)不同C和養(yǎng)分添加處理間的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，采用Duncan多重比較分析不同處理間之間的差異，顯著性水平為P<0.05。所有圖件均采用Origin 9.0繪制。圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n= 4)。

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，在培養(yǎng)3天時(shí)，外源添加葡萄糖顯著提高了稻田土壤CBH活性，范圍在5.8～12.2 nmol·g-1·h-1，但隨著養(yǎng)分添加水平的增加并沒有呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。在培養(yǎng)60 d時(shí)，葡萄糖和養(yǎng)分元素共同添加的處理中，土壤CBH活性隨養(yǎng)分元素添加量的增加而顯著降低。

注：不同小寫字母表示同一培養(yǎng)時(shí)間土壤酶活性在處理間存在顯著性差異(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) between treatments in enzyme activities at each incubation time.圖1 稻田土壤酶活性的動(dòng)態(tài)變化對(duì)葡萄糖和養(yǎng)分添加的響應(yīng)趨勢Fig.1 Dynamics of enzyme activities in response to glucose and nutrient additions in paddy soils

培養(yǎng)3 d時(shí)，添加葡萄糖和養(yǎng)分元素顯著提高了土壤BG活性。然而，3 d時(shí)C與養(yǎng)分之間的化學(xué)計(jì)量比變化對(duì)土壤BG活性無顯著影響(圖1)。土壤培養(yǎng)60 d后，不添加葡萄糖試驗(yàn)組土壤BG酶活性對(duì)養(yǎng)分添加水平無顯著響應(yīng)，而在外源添加葡萄糖的試驗(yàn)組，土壤BG活性隨著養(yǎng)分元素添加量的增加而顯著降低(圖1)。

培養(yǎng)3 d時(shí)，外源添加葡萄糖顯著提高了稻土壤NAG活性(圖1)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(60 d)，添加葡萄糖與未添加葡萄糖的處理之間土壤NAG活性基本無明顯差異。在同時(shí)添加葡萄糖和養(yǎng)分時(shí)，土壤NAG活性隨元素計(jì)量比增加而逐漸降低。

培養(yǎng)3 d時(shí)，葡萄糖添加增加了土壤AP活性，但養(yǎng)分添加水平對(duì)其影響不顯著。在培養(yǎng)60 d時(shí)，土壤AP活性隨養(yǎng)分元素添加量的增加而降低，尤其是在有葡萄糖添加的條件下，AP活性隨養(yǎng)分水平的增加而顯著降低(圖1)。

分析4種酶活性與養(yǎng)分添加水平的關(guān)系，在只添加養(yǎng)分元素的試驗(yàn)組，3 d和60 d時(shí)的4種酶活性與養(yǎng)分元素添加水平?jīng)]有顯著性相關(guān)性。而在葡萄糖和養(yǎng)分元素共同添加的試驗(yàn)組，只有在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(60 d)，4種酶活性與養(yǎng)分元素添加水平表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖2)。

注：*表示顯著性(*P<0.05; **P<0.01)。下同。Notes: * and ** indicate the significant differences at P<0.05 and P<0.01,respectively.The same is as below.圖2 培養(yǎng)60天后添加葡萄糖組土壤酶活性與養(yǎng)分元素添加水平之間的關(guān)系Fig.2 Relationship between enzyme activities and nutrient addition levels in the presence of glucose addition after 60 days incubation

通過線性擬合發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3 d時(shí)，(BG+CBH)/NAG和(BG+CBH)/AP與養(yǎng)分添加水平之間均無顯著相關(guān)性(圖3)。而在培養(yǎng)60 d時(shí)，(BG+CBH)/NAG與養(yǎng)分添加水平之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(R2=0.75,P<0.01)；(BG+CBH)/AP與養(yǎng)分添加水平之間表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(R2=0.88,P<0.01)。

圖3 參與碳氮磷循環(huán)的土壤酶活性計(jì)量比與養(yǎng)分元素添加水平之間的關(guān)系Fig.3 Relationship between stoichiometry of soil enzyme activities and nutrient addition levels

3 討 論

土壤酶是分解有機(jī)質(zhì)的直接媒介，可溶解植物的細(xì)胞壁，解聚大分子，并最終產(chǎn)生能夠被微生物同化利用的可溶性底物[7]。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，胞外酶活性的大小、特性和分布特征可以反映出養(yǎng)分有效性、有機(jī)質(zhì)組成和特性以及微生物群落功能多樣性的差異[2]。微生物生長與代謝活性依賴于能量與物質(zhì)的攝入，其中能量的消耗需要更多的C源供應(yīng)，而物質(zhì)的攝入主要需要更多的C和N供應(yīng)。本研究中，葡萄糖添加在初期(3天)顯著增加4種土壤酶(CHB、BG、NAG和AP)活性，這表明葡萄糖提供的C源可增加微生物的活性和胞外酶的合成與分泌，促進(jìn)其參與土壤C、N、P的代謝[24-25]，導(dǎo)致胞外酶活性增加[26-27]。然而，隨著外源易利用態(tài)C源的消耗，在60 d時(shí)，添加葡萄糖處理的4種酶活性隨養(yǎng)分添加量的增加而顯著降低，尤其是在高養(yǎng)分添加條件下。這可能是因?yàn)?，添加葡萄糖在短期?nèi)促進(jìn)了土壤微生物生長，增加了土壤微生物對(duì)土壤原有有機(jī)碳中活性組分的分解和利用[7]。相反地，在試驗(yàn)后期，隨著土壤中可利用態(tài)有機(jī)碳組分的耗竭，微生物C源與能量的供應(yīng)量降低，土壤胞外酶活性呈現(xiàn)降低的趨勢[7]。相對(duì)于低養(yǎng)分添加水平，高養(yǎng)分添加能夠進(jìn)一步增加微生物對(duì)C的代謝消耗，增加微生物的C源限制，從而降低了微生物胞外酶活性。

在同時(shí)添加葡萄糖和養(yǎng)分的處理中，4種土壤胞外酶活性均隨著養(yǎng)分元素的增加而不斷降低，這主要是由于N、P等養(yǎng)分限制性減弱引起的。在60 d時(shí)，4種酶活性均與養(yǎng)分添加水平呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖2)，這也進(jìn)一步證實(shí)了土壤酶活性與養(yǎng)分有效性之間的負(fù)反饋效應(yīng)。在未添加葡萄糖處理中，酶活性與養(yǎng)分元素添加水平?jīng)]有表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，可能是因?yàn)槲⑸锸蹸源限制而降低了其對(duì)養(yǎng)分梯度的響應(yīng)靈敏性。外源C和養(yǎng)分輸入可能會(huì)顯著改變土壤中元素之間的生態(tài)化學(xué)計(jì)量平衡，而土壤微生物通過改變參與限制性養(yǎng)分循環(huán)的土壤酶活性，使該養(yǎng)分與C之間達(dá)到微生物生長所需的、較為適宜的生態(tài)化學(xué)計(jì)量比。Sinsabaugh等[7]分析了陸地生態(tài)系統(tǒng)中參與C、N、P周轉(zhuǎn)的土壤酶活性及其化學(xué)計(jì)量學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)調(diào)控C、N、P循環(huán)的水解酶活性的平均比值大約是1∶1∶1，表明穩(wěn)定的土壤生態(tài)系統(tǒng)中參與土壤關(guān)鍵元素循環(huán)的酶活性會(huì)保持相對(duì)穩(wěn)定的比值關(guān)系。隨著土壤C∶N∶P化學(xué)計(jì)量比的變化，土壤微生物能通過調(diào)節(jié)自身的生長和代謝過程，重新分配參與土壤C、N、P等元素循環(huán)的酶活性之間的比例，對(duì)土壤C、N、P等元素間的化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，從而維持土壤物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)之間的平衡[27-28]。因此，在不同的C、N、P計(jì)量比條件下，微生物將提高相應(yīng)的酶活性，從土壤中獲取生長所需的養(yǎng)分元素，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)維持自身計(jì)量學(xué)內(nèi)穩(wěn)性。

分析土壤酶活性計(jì)量比與養(yǎng)分添加水平直接的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)60天時(shí)，碳水解酶與氮水解酶的比值[(BG+CBH)/NAG]與養(yǎng)分添加水平之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(圖3)。這表明隨著養(yǎng)分元素的投入，尤其是無機(jī)氮的增加，有效降低了微生物對(duì)氮素受限程度，因?yàn)槲⑸锊恍枰置诘饷溉カ@取土壤中的氮源滿足生長的需要[29]。然而，碳水解酶與磷水解酶的比值[(BG+CBH)/AP]與養(yǎng)分添加水平之間表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖3)，這與碳磷水解酶比值和養(yǎng)分添加水平的關(guān)系相反，可能主要是因?yàn)楸狙芯恐械乃就撂幱诹资芟逘顟B(tài)，而且在這種水稻土中當(dāng)有無機(jī)磷添加到土壤中后，無機(jī)磷又會(huì)很快被土壤吸附固定，使得微生物難以利用[30-32]。所以，隨著養(yǎng)分元素添加水平的增加，氮硫等元素相對(duì)充足，而磷就成為了受限的一種元素，因而微生物需要相對(duì)增加磷酸酶的分泌來獲取磷，從而維持其生物量和環(huán)境資源的元素計(jì)量學(xué)平衡[28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期(3 d)和后期(60 d)碳和養(yǎng)分添加對(duì)亞熱帶稻田土壤β-1,4-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性的影響存在較大的差異。這表明，稻田土壤胞外酶活性對(duì)可利用態(tài)C和養(yǎng)分有效性變化的響應(yīng)受培養(yǎng)時(shí)間的影響，這主要是由于農(nóng)田土壤微生物能動(dòng)態(tài)地調(diào)整胞外酶的分泌數(shù)量和活性，以適應(yīng)外界C和養(yǎng)分有效性的變化[27-28]。然而，C和養(yǎng)分輸入的變化對(duì)土壤酶活性的影響是一個(gè)長期的過程，而且長期效應(yīng)可能與短期效應(yīng)并不一致[4]。盡管本研究揭示了C和養(yǎng)分添加對(duì)稻田土壤酶活性的短期影響，但為了更好地認(rèn)知土壤酶活性的時(shí)間動(dòng)態(tài)變化格局，在今后的研究中應(yīng)設(shè)計(jì)長時(shí)間序列的室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，明確C和養(yǎng)分添加對(duì)亞熱帶稻田土壤酶活性及其化學(xué)計(jì)量特性的長期影響。

4 結(jié) 論

(1)外源碳和養(yǎng)分添加對(duì)稻田土壤酶活性的影響取決于培養(yǎng)時(shí)間。在培養(yǎng)初期(3 d)，外源葡萄糖添加提高土壤胞外酶活性；在培養(yǎng)結(jié)束(60 d)后，在葡萄糖添加的條件下，土壤酶活性隨養(yǎng)分添加量的升高而降低。

(2)養(yǎng)分添加水平影響稻田土壤酶活性的化學(xué)計(jì)量特征。養(yǎng)分添加降低了土壤微生物對(duì)氮素的限制程度，提高了碳水解酶與氮水解酶的計(jì)量比；而高養(yǎng)分添加加劇了微生物磷的受限程度，增加了磷酸酶活性，降低了碳水解酶與磷水解酶的計(jì)量比。

(3)在秸稈還田等外源有機(jī)碳輸入過程中，通過配施無機(jī)肥可以實(shí)現(xiàn)調(diào)控亞熱帶稻田土壤元素計(jì)量比，促進(jìn)土壤碳氮磷轉(zhuǎn)化酶活性的產(chǎn)生，加快土壤有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)，最終通過活化土壤養(yǎng)分元素和增加微生物殘留物的積累而提升稻田土壤肥力和生產(chǎn)力。