李書鑫，徐 婷，李 慧，楊文瑩，藺吉祥，朱先燦,

(1.東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長春130102； 3.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000; 4.東北林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

0 引 言

過去的幾十年，極端天氣頻繁發(fā)生，并且程度越來越劇烈，對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生了極大地影響[1-2]，其中，低溫脅迫通過影響植物的水分吸收、質(zhì)膜穩(wěn)定、酶活性、光合能力和活性氧(ROS)平衡，最終導(dǎo)致植物受到傷害，甚至死亡[3]。玉米是我國主要的糧食和飼料作物，對保障我國糧食安全具有重要意義。2018年，我國糧食作物播種面積為1.17億hm2，其中玉米播種面積為0.421億hm2，占全國糧食作物播種面積的36%，超過稻谷和小麥的播種面積，其中，東北地區(qū)是我國重要的玉米主產(chǎn)區(qū),屬世界三大“黃金玉米帶”之一，2018年玉米播種面積為0.132億hm2，占全國玉米播種總面積的31.5%，年產(chǎn)量8 444.8萬t，占全國玉米產(chǎn)量的32.8%[4]。但是，東北地區(qū)處于高緯度地區(qū)，全年熱量資源有限，2018年東北地區(qū)冷凍災(zāi)受災(zāi)面積為386.3千hm2，占全國受災(zāi)面積的11.3%，東北玉米生育階段冷害強(qiáng)度具有較強(qiáng)的周期性，易受階段性低溫冷害的不利影響，低溫冷害會(huì)造成玉米生育期推遲、授粉受阻及灌漿緩慢，最終導(dǎo)致玉米產(chǎn)量下降[4-6]。其中，光合作用是玉米對低溫敏感的重要生理過程之一。

許多研究表明，低溫脅迫可以直接損傷植物葉片光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)反應(yīng)中心，降低光化學(xué)效率，削弱CO2同化能力[7-8]。低溫脅迫還可以通過間接影響植物葉片的氣孔開閉、光合產(chǎn)物的產(chǎn)生與運(yùn)輸以及水分吸收等因素影響葉片的光合作用[9]。但對于低溫脅迫下光合作用復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程尚不完全了解。植物光合能力的強(qiáng)弱可以反映在多種參數(shù)的改變上，其中，利用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)可以細(xì)致深入地分析植物葉片光合系統(tǒng)特別是PS Ⅱ的原初光化學(xué)反應(yīng)。艾佳等[10]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫導(dǎo)致玉米幼苗初始熒光FO增加，凈光合速率(Pn)、FV/FO、最大光化學(xué)效率(FV/Fm)減少，并且在不同的脅迫溫度和脅迫時(shí)間下，F(xiàn)O、Pn、FV/FO和FV/Fm變化幅度不同。然而，基于快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP曲線)的玉米幼苗葉片響應(yīng)低溫脅迫的研究較少，玉米葉片PS Ⅱ?qū)Φ蜏孛{迫的光合響應(yīng)機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

本研究以玉米幼苗葉片為試驗(yàn)材料，通過采集低溫脅迫后的玉米葉片的熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)，繪制快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP曲線)，基于JIP-test分析，揭示玉米葉片PS Ⅱ?qū)Φ蜏孛{迫的防御保護(hù)機(jī)制，以期為完善玉米低溫逆境光合生理學(xué)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

玉米品種“鄭單958”為供試材料，開展盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)土壤取自吉林省德惠市，土壤主要化學(xué)性質(zhì)為：pH為6.6，有機(jī)質(zhì)含量26.9 g·kg-1，有效氮含量118.8 mg·kg-1，有效磷含量18 mg·kg-1,速效鉀含量111 mg·kg-1。

1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定和OJIP曲線的繪制

低溫處理后，使用FluorPen FP 110(Photon System Instruments,Drasov,Czech Republic)分別對常溫和低溫脅迫處理的8株長勢相同的玉米幼苗倒二葉進(jìn)行測定。在測定之前，進(jìn)行20 min的暗處理，使用455 nm的藍(lán)光連續(xù)照射，同時(shí)使用2 400 μmol·m-2·s-1的1s飽和光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒?。以葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度為縱坐標(biāo)，葉綠素?zé)晒夥磻?yīng)時(shí)間的對數(shù)形式為橫坐標(biāo)做出一個(gè)包含多相的上升曲線。其中20 μs測量的熒光強(qiáng)度為O相熒光強(qiáng)度(FO)，在300 μs時(shí)的熒光強(qiáng)度表示為K相熒光強(qiáng)度(FK)，2 ms測量的熒光強(qiáng)度J相熒光強(qiáng)度(FJ)，30 ms測量的熒光強(qiáng)度I相熒光強(qiáng)度(FI)，最后達(dá)到最大熒光強(qiáng)度Fm(P相)。同時(shí)對曲線進(jìn)行JIP-test分析，得到其他熒光參數(shù)。熒光參數(shù)表示的生物學(xué)意義見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，利用SPSS 20.0分析軟件對低溫脅迫和常溫條件下測得的葉綠素?zé)晒鈪?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，顯著水平為0.05，利用Origin 2018繪制圖表。

表1 JIP-test 快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP)的參數(shù)Table 1 Parameters used by JIP-test for the analysis of the fluorescence transient OJIP

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對玉米葉片OJIP曲線的影響

圖1 常溫和低溫脅迫條件下的OJIP曲線以及標(biāo)準(zhǔn)化的O-J相曲線WOJ、J-I相曲線WJI和I-P相曲線WIP值Fig.1 Average OJIP transient and WOJ,WJI,WIP under ambient temperature and low temperature

2.2 低溫脅迫對玉米葉片基礎(chǔ)熒光參數(shù)的影響

進(jìn)一步分析熒光參數(shù)，低溫脅迫對玉米葉片的光合作用產(chǎn)生了重要影響。由圖2可知，玉米葉片在低溫脅迫和常溫條件下的FO基本沒有變化，而低溫脅迫下的Fm是常溫條件下的44.7%。低溫脅迫的FV/FO為1.93，而常溫條件下，F(xiàn)V/FO為5.64，說明低溫脅迫造成了FV/FO大幅度減少。WK和OEC主要反映PS Ⅱ供體側(cè)變化。相比于常溫處理，低溫脅迫下WK顯著增加44.7%，而OEC減少了13.1%。Sm、MO、N主要反映PS Ⅱ受體側(cè)變化，低溫脅迫下的Sm、MO、N比常溫條件下增加210%、49.6%、294%。此外，低溫脅迫下J和I相的相對可變熒光(Vj和Vi)則呈相反結(jié)果，Vj增加19.7%，而Vi減少16.4%。

2.3 低溫脅迫對玉米葉片量子產(chǎn)額和能量分配比率的影響

本試驗(yàn)條件下，低溫脅迫促使φPo減少24.9%(圖3A)，φEO和捕獲的激子將電子傳遞QA下游其他電子受體的比率(ψO)分別減少29.7%、6.82%(圖3B、D)，且均達(dá)極顯著水平。相反，用于熱耗散的量子比率(φDO)較常溫處理增加了141%(圖3C)，說明低溫脅迫抑制了玉米葉片光化學(xué)反應(yīng)的效率，導(dǎo)致熱耗散增加。

注：**表示在0.01水平上差異極顯著(P<0.01)，ns表示差異不顯著。下同。Note: **means significant differences between treatments at 0.01 level.ns means no significant differences between treatments.The same is as below.圖2 常溫和低溫脅迫條件下葉片熒光參數(shù)雷達(dá)圖Fig.2 Fluorescence parameters radar plot of maize leaves under ambient temperature and low temperature

圖3 常溫和低溫脅迫條件下捕獲的激子將電子傳遞QA下游其他電子受體的比率(ψO)、最大光化學(xué)活性(φPo)、用于電子傳遞的量子產(chǎn)額(φEO)和熱耗散的量子比率(φDO)Fig.3 Quantum efficiency or flux ratios (ψO,φPo,φEO,and φDO) of maize leaves under ambient temperature and low temperature

2.4 低溫脅迫對玉米葉片比活性參數(shù)和性能指數(shù)的影響

相比于常溫處理，低溫脅迫下ABS/RC、TRO/RC、單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETO/RC)、DIO/RC分別增加70.4%、24.7%、16.1%和328%，其中DIO/RC增幅最大(圖4A、B、C、D)。RC/CSO表示單位面積有活性反應(yīng)中心密度，低溫脅迫造成RC/CSO顯著下降，僅為常溫條件下的62%(圖4E)。以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)(PIABS)對脅迫程度更為敏感，低溫脅迫下減少81.6%(圖5A)。以單位面積為基礎(chǔ)的性能指數(shù)(PICSm)也表現(xiàn)出相同的趨勢，低溫脅迫下減少90.6%(圖4F)。這說明低溫脅迫不僅迫使玉米葉片反應(yīng)中心光能捕獲及分配發(fā)生變化，甚至?xí)斐蒔SⅡ反應(yīng)中心失活。

圖4 常溫和低溫脅迫條件下比活性參數(shù)和性能指數(shù)Fig.4 Specific energy fluxes and performance indexes of maize leaves under ambient temperature and low temperature

3 討 論

植物可以通過光合作用為自身生長發(fā)育提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，而低溫脅迫可破壞植物的光合系統(tǒng)，影響葉綠素?zé)晒夂腿~綠素合成[11-13]。許多研究表明，植物葉片PS Ⅱ?qū)γ{迫敏感且響應(yīng)快速。因此，對植物葉片PS Ⅱ產(chǎn)生的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行研究，可以深入揭示低溫脅迫下植物的能量產(chǎn)生與傳遞變化規(guī)律[14-15]。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫對玉米葉片的OJIP曲線產(chǎn)生明顯的影響，改變了特征位點(diǎn)。

φPo是表示植物受光抑制的指標(biāo)，可以用來衡量植物所受脅迫的嚴(yán)重程度[16-17]。本試驗(yàn)中，低溫脅迫一方面促使φPo下降，造成葉片PS Ⅱ產(chǎn)生光抑制；另一方面，PIABS在低溫脅迫下的降幅更大，說明整個(gè)PS Ⅱ的結(jié)構(gòu)和功能也都受到了嚴(yán)重抑制，這與前人研究報(bào)道表明PIABS對非生物脅迫更加敏感結(jié)果相一致[16,18-19]。與常溫相比，低溫脅迫下FO基本沒有顯著差異，而FV/FO下降比較明顯，表明PS Ⅱ的潛在活性下降。φPo(FV/Fm)和FV/FO的下降表明低溫脅迫處理減少了PS Ⅱ的量子產(chǎn)率和提供給PS Ⅱ的電子數(shù)量[20]。

有研究表明，低溫可以造成放氧復(fù)合體損傷，OJIP曲線中出現(xiàn)K相，并且WK增大[21]。本研究利用JIP-test對玉米葉片PS Ⅱ供體側(cè)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下的WK同樣增大，且OCE僅為0.869，這也說明放氧復(fù)合體受到了損傷。此外，放氧復(fù)合體催化H2O分解，為電子傳遞鏈提供電子[22-23]，低溫脅迫下Fm降低也與放氧復(fù)合體損傷造成的水光解受到抑制有關(guān)。以上結(jié)果說明，本試驗(yàn)條件下的低溫脅迫，導(dǎo)致玉米葉片PS Ⅱ供體側(cè)的放氧復(fù)合體損傷，造成電子產(chǎn)生和傳遞受阻。

對PS Ⅱ反應(yīng)中心進(jìn)行JIP-test分析，有助于進(jìn)一步研究植物葉片光合變化。前人針對冬小麥(Triticumaestivum)[20]、銀杏(Ginkgobiloba)[16]、向日葵(Helianthusannuus)[28]等的PS Ⅱ反應(yīng)中心對脅迫響應(yīng)變化已進(jìn)行相應(yīng)分析，而對于低溫脅迫下玉米PS Ⅱ反應(yīng)中心的JIP-test分析還鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下玉米葉片的ABS/RC、TRO/RC、ETO/RC、DIO/RC增加，而RC/CSO減少，表明反應(yīng)中心失活數(shù)量上升，但單個(gè)反應(yīng)中心的效率增強(qiáng)。進(jìn)一步分析各個(gè)比活性參數(shù)(單位反應(yīng)中心)發(fā)現(xiàn)，每個(gè)反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)增加倍數(shù)較高，同樣反映出單個(gè)反應(yīng)中心的效率增強(qiáng)。同時(shí)，每個(gè)反應(yīng)中心捕獲的能量(TRO/RC)和每個(gè)反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量(ETO/RC)增加的倍數(shù)基本相同，但每個(gè)反應(yīng)中心耗散的能量(DIO/RC)急劇增加，這表明PS Ⅱ反應(yīng)中心吸收和捕獲的光能，優(yōu)先推動(dòng)PS Ⅱ電子向下傳遞，以熱量形式耗散的能量增加(圖5)。

植物葉片在受到低溫脅迫后，保證自身電子傳遞的基礎(chǔ)上，將多余的能量以熱量形式散失，從而減少ROS的產(chǎn)生[29-30]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后用于熱耗散的量子比率(φDO)升高，也證明低溫脅迫后玉米葉片吸收的多余能量，多以熱量形式耗散。先前對小麥的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫造成小麥葉片單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額(ETO/CSm或ETO/CSO)減少，尤其是WIP下降，表明低溫脅迫下PS Ⅰ驅(qū)動(dòng)電子從PQH2流向PS Ⅰ受體側(cè)的末端電子受體過程受到抑制，電子傳遞受阻[20,31]。這說明C4植物可能對低溫脅迫的光合響應(yīng)過程與C3植物不同。

圖5 類囊體膜中的PS Ⅱ的比活性參數(shù)變化模式圖Fig.5 Specific fluxes models (membrane models) under ambient temperature and low temperature

綜合以上分析可以得出，玉米葉片的光合過程對低溫脅迫敏感，容易造成PS Ⅱ的損傷[32]，其表現(xiàn)的響應(yīng)機(jī)制是：PS Ⅱ供體側(cè)的放氧復(fù)合體損傷，導(dǎo)致PS Ⅱ的供體側(cè)提供電子的能力下降，反應(yīng)中心失活數(shù)量上升，而單個(gè)反應(yīng)中心的效率增強(qiáng)，多余能量以熱量形式散失，減少ROS產(chǎn)生。在低溫脅迫下QA到QB的電子傳遞效率降低，而隨后的PQ庫增加，QB到PS Ⅰ下游電子傳遞能力提高。低溫脅迫造成的玉米葉片供體側(cè)損傷，將抑制電子的傳遞，影響光合能力。