李 燦,劉 丹,羅常春,柳玉佳,王莘智

1.湖南中醫(yī)藥大學(長沙 410208);2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 (長沙 410021)

強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一種以中軸關節(jié)受累為主，伴有葡萄膜炎、腸道炎癥等關節(jié)外表現(xiàn)，嚴重者可出現(xiàn)脊柱畸形和關節(jié)強直的慢性炎癥性疾病[1]。我國男性患病率顯著高于女性[2-3]。纖維軟骨炎癥、骨侵蝕及新骨形成是AS的三大病理特征[4]，其晚期由于附著點、關節(jié)軟骨等的骨化造成的難逆性病變是影響疾病預后的主要原因，因此新骨形成的機制是目前研究的重點。

壯督驅(qū)寒合劑是我院風濕科經(jīng)驗方，具有補腎壯督、散寒祛濕、通絡利節(jié)的功效，經(jīng)臨床應用發(fā)現(xiàn)壯督驅(qū)寒合劑能夠顯著降低AS患者疾病活動程度，改善患者臨床癥狀，且安全可靠。目前研究表明微小RNA(Micro RNA，miRNA)是骨形成及骨重塑過程中的關鍵調(diào)節(jié)因子[5]，其中miR-29a(microRNA 29a，miR-29a)在成骨細胞分化過程中表達上調(diào)[6]，與強直性脊柱炎的骨化密切相關，它可能通過下調(diào)DKK-1(Dickkopf1，DKK-1)的表達來激活Wnt信號通路，從而影響AS新骨形成[7]。本研究擬以蛋白聚糖誘導的AS小鼠為模型，通過檢測miR-29a及Wnt 通路相關細胞因子的表達，探討其對Wnt通路的調(diào)控作用，為壯督驅(qū)寒合劑治療AS提供理論基礎。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：SPF級6～8周雌性Balb/c小鼠(20±2)g，50只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF級動物房，飼以普通飼料，自由攝食攝水，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物制備：壯督驅(qū)寒合劑(組成：蒼術、白術、杜仲各20 g，獨活、狗脊、桂枝、乳香、沒藥各10 g，麻黃、甘草各5 g，所有中藥均由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一加工為免煎顆粒劑)。塞來昔布膠囊，國藥準字：J20140072，規(guī)格：0.2 g/片。以上藥物均按照體表面積進行換算，每公斤體重小鼠的給藥量為人的9.1倍，換算為小鼠等效劑量，現(xiàn)用現(xiàn)溶。

1.3 試劑及儀器：蛋白聚糖(Sigma公司，貨號：D-8428)；完全弗式佐劑(Sigma公司，貨號：F5881)；RIPA裂解液(中國上海碧云天，貨號：P0013B)；蛋白酶抑制劑(中國北京金泰宏達，貨號：583794)；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture、DM2000 Plus DNA Marker(中國北京康為世紀，貨號：CW2569、CW2141、CW2601、CW0632)；總RNA提取試劑盒Trizol(美國Thermo，貨號：15596026)；熒光定量RCP儀、熒光PCR板(美國Thermo 公司，貨號：PIKOREAL96、SPL0960)；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(中國北京六一，貨號：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D)；生物樣品均質(zhì)儀(中國杭州奧盛，貨號：BioPrep-24)。

2 實驗方法

2.1 分組、模型建立：將小鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、西藥組、中藥低劑量組及中藥高劑量組，每組各10只。除空白組外，其余四組均按以下方法復制為AS模型：將100 μg蛋白聚糖與等體積完全弗氏佐劑混合均勻，腹腔注射蛋白聚糖乳劑0.2 ml，首次免疫分別于第21天、第42天進行加強免疫，再次腹腔注射乳劑0.2 ml[8-9]。

2.2 藥物干預：造模成功后分別灌胃相應藥物，1次/d。中藥低劑量組：壯督驅(qū)寒合劑18.2 g/(kg·d)，中藥高劑量組為36.4 g/(kg·d)，西藥組：塞來昔布60.7 mg/(kg·d)，空白組及模型組予以等量的生理鹽水，連續(xù)8周。密觀小鼠飲食及活動狀況。

2.3 動物處理：各組小鼠均在藥物干預8周后脫頸處死，于小鼠膝關節(jié)處取滑膜組織，立即放入液氮中于-80℃條件下進行儲存。

3 指標檢測

3.1 實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)測定miR-29a、DKK-1及β-catenin的mRNA(messenger RNA，mRNA)：采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計測定濃度及純度，RNA濃度(ng/μl)=A260×稀釋倍數(shù)×40，濃度在100 ng/μl～200 ng/μl，RNA純度=OD260/OD280，比值在1.8～2.0之間均可。以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，運用primer5軟件設計引物，由上海生工合成引物，采用SYBRGreen PCR試劑盒(TAKARA)，qRT-PCR技術進行基因擴增和檢測。PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，每個標本設置三個復孔，采用 2-△△ct法計算基因的相對表達量。β-actin上游序列為5’-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3’，下游序列為5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’，擴增長度為223 bp；TNF-α上游序列為5’-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3’，下游序列為5’-CACCCCGAAGTTCAGTAGACA-3’，擴增長度為162 bp，DKK1上游序列為5’-CAGTGCCACCTTGAACTCAGT-3’，下游序列為5’-CCGCCCTCATA

GAGAACTCC-3’，擴增長度為129 bp，β-catenin上游序列為5’-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3’，下游序列為5’-TGGGAGGTGTCAACATCTTCTT-3’，擴增長度為143 bp；miR-29a引物序列： 5’-ACTGATTTCTTTTGGTGTTCAG-3’。

3.2 免疫印跡法(Western blotting)檢測β-catenin、DKK-1蛋白含量：取各組骶髂關節(jié)滑膜組織加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。加入5×loading buffer混勻，沸水煮5 min放入冰盒速冷備用充分變性蛋白。進行 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印于NC膜，封閉，加一抗室溫孵育90 min后加二抗室溫孵育90 min，選用ECL化學發(fā)光液顯色曝光，以β-actin為內(nèi)參，對雜交帶進行掃描分析，比較蛋白的相對表達。

結(jié) 果

1 壯督驅(qū)寒合劑對miR-29a表達的影響 見表1。與空白組相比，其余各組miR-29a表達水平均顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，其余各組miR-29a表達水平均顯著下降(P<0.01)，與中藥低劑量組和西藥組相比，中藥高劑量組表達有所下降(P<0.01)。

2 壯督驅(qū)寒合劑對Wnt通路相關細胞因子mRNA表達的影響 見表1。與空白組相比，其余各組DKK-1 mRNA表達水平均顯著下降(P<0.01)，β-catenin mRNA表達水平均顯著增高(P<0.01)，與模型組相比，其余各組DKK-1 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.01)，β-catenin mRNA表達水平均顯著下降(P<0.01)，與中藥低劑量組和西藥組相比，中藥高劑量組DKK-1 mRNA表達升高(P<0.01)，β-catenin mRNA表達下降(P<0.01)。

表1 各實驗組miR-29a、DKK-1 mRNA及β-catenin mRNA基因定量檢測2-△△ct值

3 壯督驅(qū)寒合劑對Wnt通路相關細胞因子蛋白表達的影響 見表2(圖1)。與空白組相比，其余各組DKK-1蛋白表達均有下降(P<0.05)，β-catenin蛋白表達均有增高(P<0.05)；與模型組相比，其余各組DKK-1蛋白表達均有增高(P<0.05)，β-catenin蛋白表達均有下降(P<0.05)；與中藥低劑量組及西藥組相比，中藥高劑量組DKK-1表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，β-catenin表達下降。

表2 各實驗組DKK-1、β-catenin蛋白相對表達量

A.DKK-1 western blot 電泳圖；B:β-catenin western blot 電泳圖

討 論

強直性脊柱炎是一種免疫介導的以骶髂關節(jié)炎及軸向炎癥為特征的全身性炎癥性疾病[10]，早期表現(xiàn)為炎性腰背及臀部疼痛，晚期由于外纖維環(huán)、韌帶及關節(jié)軟骨等的骨化逐漸出現(xiàn)“竹節(jié)樣”脊柱[11]。新骨形成、骨量減少、骨質(zhì)疏松等骨代謝異常是AS的特征性表現(xiàn)，其中新骨形成是疾病發(fā)展的重要原因[4,12]。miRNA是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的短非編碼RNA，調(diào)控著至少1/3的人類編碼蛋白基因，參與了多個系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，比如強直性脊柱炎。miRNA對細胞因子表達、調(diào)節(jié)T細胞存活信號、促炎途徑及骨代謝的調(diào)控在AS的發(fā)病中起重要作用[13]。近期研究表明miRNA對成骨分化上游信號、重要信號通路及下游基因均起到重要調(diào)控作用[14-15]，與AS新骨形成密切相關，可能通過經(jīng)典Wnt通路、BMP(Bone morphogenetic protein，BMP)信號通路參與AS新骨形成[6,16]，其中miR-29a是成骨細胞分化中不可缺少的代表性miRNA，主要通過靶向典型 Wnt/β-catenin 通路來調(diào)控成骨細胞的分化[13]。Wnt/β-catenin信號通路通過多途徑誘導間充質(zhì)細胞分化為成骨細胞參與骨形態(tài)發(fā)生和骨代謝穩(wěn)態(tài)[17]，是參與AS新骨形成的關鍵信號通路，DKK1被認為是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵抑制因子。多項研究發(fā)現(xiàn)，AS患者中的miR-29a、β-catenin的表達高于對照組，Dkk-1的表達低于對照組，且miR-29a與Dkk-1的表達呈負相關，與β-catenin的表達呈正相關[18]，表明miR-29a主要通過下抑制DKK1的表達從而激活Wnt /β-catenin途徑參與AS新骨形成[7]。因此可以從 miR-29a調(diào)控Wnt/β-catenin 通路來進一步研究中醫(yī)改善 AS骨化的可能機制。

根據(jù)強直性脊柱炎的臨床特點，中醫(yī)將其歸為痹病范疇。歷代醫(yī)家多認為本病由內(nèi)外合邪而致，如《素問·生氣通天論》曰：“陽氣者，精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋。開闔不得，寒氣從之，乃生大僂?！薄夺t(yī)宗必讀》言“有寒、有濕、有風熱、有挫閃、有瘀血、有滯氣、有痰積，皆標也，腎虛其本也。”我們結(jié)合臨床論治經(jīng)驗，認為本病病機可歸納為“虛、邪”。腎虛督寒是本病發(fā)病的關鍵，風寒濕等外侵是其誘發(fā)因素，正虛邪侵，日久不愈，痰瘀互結(jié)，終至筋攣骨損，脊背強直廢用。腎藏精，主骨主髓，腎氣虧虛，表現(xiàn)為關節(jié)破壞及骨質(zhì)疏松。督脈行于脊背，通于腎，總督人身諸陽，風寒外襲，寒凝督脈而致筋脈攣急，脊背強直，屈伸不利。故本病應以補腎強督，祛風散寒為基本治則。另外瘀血貫穿疾病始終，疼痛夜甚是其重要表現(xiàn)，夜間陽氣入陰，氣不行血，致血行不暢，不通則痛，故治療的同時應注意活血化瘀藥的配伍。壯督驅(qū)寒合劑由我們臨床治療AS的經(jīng)驗方化裁而成，方中狗脊苦甘溫，苦能燥濕，甘能益血，溫能養(yǎng)氣，善補肝腎，強腰脊，祛風濕，是補而能走之藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰其：“主腰背強，機關緩急，周痹寒濕，膝痛”為君藥。杜仲甘溫，入肝腎經(jīng)，助狗脊補肝腎，強筋骨；獨活祛風除濕，通痹止痛；蒼術合白術燥濕健脾；乳香合沒藥行氣活血；桂枝則取其溫通經(jīng)脈，調(diào)和營衛(wèi)之效；麻黃性溫，合白術能除濕通絡止痛，白術又可佐制麻黃發(fā)汗太過之弊；甘草通經(jīng)脈，利血氣，調(diào)和諸藥，全方共奏補腎壯督，祛寒除濕，活血通絡之效。

本研究通過復制AS小鼠進行藥物干預，通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，應用壯督驅(qū)寒合劑的AS小鼠DKK-1蛋白表達較模型組增加，β-catenin蛋白表達較模型組減少，提示壯督驅(qū)寒合劑抑制AS新骨形成的機制可能與Wnt/β-cateni信號通路相關。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，壯督驅(qū)寒合劑可下調(diào)AS小鼠中mi-R29a、β-catenin mRNA的表達，上調(diào)DKK-1 mRNA的表達，說明壯督驅(qū)寒合劑可能通過miR-29a來抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而起到延緩AS的新骨形成的作用。同時結(jié)果顯示中藥高劑量組對mi-R29a及Wnt/β-catenin信號通路的影響優(yōu)于中藥低劑量組及西藥組，表明壯督驅(qū)寒合劑對AS小鼠新骨形成的抑制作用存在一定的量效關系，后續(xù)我們將設置不同藥物濃度的組別，進行在體和離體實驗，進一步觀察壯督驅(qū)寒合劑對miR-29a、Wnt/β-catenin信號通路及其上下游更多細胞因子的影響，以便更好的闡釋壯督驅(qū)寒合劑治療AS的藥物機理。