蔡 茗，邵 峰，林先盛，陶 冶，王思雨,黃 強

胰腺癌是一種的高惡性程度的消化道腫瘤，其發(fā)病率逐年攀升，患者預(yù)后極差。胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSCs)是一種位于胰腺周圍的間質(zhì)細(xì)胞，在正常胰腺中處于靜息狀態(tài),而在胰腺癌的背景下，PSCs會被激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顟B(tài)[1-3]。激活態(tài)PSCs可以通過特定的基因來調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究[4]表明circRNA具有保守的結(jié)合位點，能以“分子海綿”的形式結(jié)合特定的促癌microRNA來使其下調(diào)，從而促進胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前已有研究證實組織塊外植法和改良的酶消化密度梯度離心法可以分離出正常胰腺相關(guān)胰腺星狀細(xì)胞(normal pancreas-associated pancreatic stellate cells ，NaPSCs)與癌癥相關(guān)胰腺星狀細(xì)胞(cancer-associated pancreatic stellate cells，CaPSCs)[1-3]。該實驗在此基礎(chǔ)上，以NaPSCs和CaPSCs作為切入點，以期尋找與CaPSCs調(diào)控胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的circRNA及其下游靶基因，進一步闡明胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的信號通路和生物學(xué)過程，同時為胰腺癌的靶向治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑CaPSCs和NaPSCs由本課題組分離、純化、培養(yǎng)得到。人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1購自中科院上海細(xì)胞庫。DMEM購自美國HyClone公司；胎牛血清(FBS) 購自以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗均購自美國賽默飛世爾科技公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。轉(zhuǎn)錄組高通量測序和隨后的生物信息學(xué)分析在上海Genergy Biotech公司進行。

1.2 細(xì)胞系

1.2.1Panc-1細(xì)胞系 將Panc-1在添加了雙抗(100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基(10% FBS)中于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2CaPSCs和NaPSCs 本研究收集了安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科2018年1～12月間的5例胰腺癌患者手術(shù)切除的胰腺癌組織和5例胰腺良性疾病患者手術(shù)切除的正常胰腺組織，按組織塊外植法和改良的酶消化密度梯度離心法[1-3]對NaPSCs和CaPSCs進行分離，純化。之后均在添加了雙抗的DMEM(10% FBS)培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞共培養(yǎng)將CaPSCs和NaPSCs分別與Panc-1細(xì)胞以Transwell體系進行共培養(yǎng)(6孔板)，上層小室規(guī)格為4.6 cm2，在其中接種4×105個Panc-1細(xì)胞。下層孔板規(guī)格為9.6 cm2，在其中分別接種4×105個來源于不同患者的NaPSCs和CaPSCs，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)24 h再用于檢測。

1.4 Panc-1細(xì)胞CCK-8檢測將來自于不同患者的CaPSCs和NaPSCs共培養(yǎng)體系中的Panc-1細(xì)胞消化后，接種于96孔板中(3×103個細(xì)胞/孔)。然后參照CCK-8試劑盒說明書進行檢測，方法如下：將處于對數(shù)生長期的Panc-1細(xì)胞進行消化后配制成細(xì)胞懸液，按3×103個細(xì)胞/孔接種于96孔板(100 μl/孔)，設(shè)置空白對照(只加培養(yǎng)基)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待檢測前每孔中加入10 μl CCK-8溶液后，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育3 h。以空白對照孔為參照調(diào)定零點，酶標(biāo)儀上450 nm處測定各孔吸光度值(OD值) ，以相對應(yīng)的OD比值表示細(xì)胞增殖能力的大小。各組取5孔平均值，繪制增殖曲線，實驗均重復(fù)3次。

1.5 NaPSCs1和CaPSCs1的RNA高通量測序從CaPSCs1和NaPSCs1中各選取3個樣本提取總RNA，分離純化后反轉(zhuǎn)錄成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，然后進行RNA高通量測序。采用Deseq-2軟件對測序數(shù)據(jù)進行差異表達(dá)分析，選取差異表達(dá)倍數(shù)≥2和P<0.05的基因作為有統(tǒng)計學(xué)意義的兩組之間的差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能和信號通路由KEGG條目的分析來表示。并使用基于Arraystar的miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件，建立ceRNA網(wǎng)絡(luò)，來預(yù)測circRNA與microRNA之間的相互作用。

1.6 qRT-PCR驗證采用TRIzol試劑盒按說明書提取CaPSCs1和NaPSCs1的總RNA，用5 μl NaPSCs1和CaPSCs1的總mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，然后在PikoReal RT-PCR系統(tǒng)(美國賽默飛世爾科技公司)上進行基于SYBR Green的RT-PCR確定RNA水平。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，以Folds=2-ΔΔCt表示目的基因在實驗組與對照組中表達(dá)的相對倍比關(guān)系。實驗重復(fù)3次，計算平均值。各基因引物序列見表1。

表1 用于環(huán)狀RNA水平qRT-PCR分析的引物序列

2 結(jié)果

2.1 Panc-1與不同來源的胰腺星狀細(xì)胞共培養(yǎng)后的CCK-8增殖能力檢測為了篩選出對Panc-1增殖能力影響最大的PSCs，將CaPSCs1～5和NaPSCs1～5與Panc-1細(xì)胞分別進行共培養(yǎng)后，對Panc-1細(xì)胞進行CCK-8實驗。CaPSCs1～5組促進Panc-1細(xì)胞增殖的能力強于NaPSCs1～5組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.09，P<0.05)，見圖1A。同時，篩選出CaPSCs1～5中CaPSCs1促進Panc-1增殖能力最強，見圖1B。篩選出NaPSCs1～5中NaPSCs1促進Panc-1增殖能力最弱，見圖1C。

2.2 RNA高通量測序篩選差異RNA根據(jù)各組的上、下調(diào)基因，以不同實驗組中和不同樣品中Log2(差異表達(dá)倍數(shù))為橫坐標(biāo)，以-Log10(P值)為縱坐標(biāo)，繪制差異表達(dá)基因的火山圖(圖2)。如圖2A所示，與NaPSCs1比較，CaPSCs1組有841個差異circRNA(其中下調(diào)的有453個,上調(diào)的有388個)，其中差異表達(dá)最明顯的circRNA為chr7:154954255|154998784(差異表達(dá)倍數(shù)=10.098，P<0.05)、chr10:12081472|12120267(差異表達(dá)倍數(shù)=10.077，P<0.05)以及chr10:76909966|77019099(差異表達(dá)倍數(shù)=9.714，P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；如圖2B所示，與NaPSCs1組比較，CaPSCs1組有8 155個差異mRNA (其中下調(diào)的有4 226個，上調(diào)的有3 929個)；如圖2C所示，與NaPSCs1比較，CaPSCs1組有73個差異microRNA (其中下調(diào)的有16個，上調(diào)的有57個)。

圖1 CCK-8細(xì)胞增殖實驗

圖2 差異表達(dá)基因火山圖

2.3 KEGG條目分析如圖3所示，以富集的差異circRNA的基因計數(shù)為橫坐標(biāo)，以差異基因富集的信號通路為縱坐標(biāo)，繪制KEGG條形圖?；蛴嫈?shù)越高，P值越小，差異基因富集越明顯 。結(jié)果表明差異circRNA主要富集的信號通路為Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、T細(xì)胞受體信號通路和HIF-1信號通路。如圖4所示，以富集的差異circRNA的基因比例為橫坐標(biāo)，以差異基因富集的生物過程為縱坐標(biāo)繪制KEGG富集q值結(jié)果圖?；虮壤礁?，P值越小，差異基因富集越明顯。結(jié)果闡明KEGG基因富集主要集中在細(xì)胞-底物連接和細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接等生物過程。

圖3 差異基因KEGG條形圖

2.4 差異circRNA的靶基因預(yù)測如表2及圖5所示，差異表達(dá)的circRNA： chr7:154954255|154998784、chr10:12081472|12120267以及chr10:76909966|77019099均有其對應(yīng)的靶基因(microRNA)。

2.5 差異circRNA的qRT-PCR驗證CaPSCs1中的3種circRNA相對表達(dá)量均高于NaPSCs1，與測序結(jié)果相符。所有結(jié)果均重復(fù)3次，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖6。

圖5 ceRNA網(wǎng)絡(luò)

圖6 3種circRNA在CaPSCs1和NaPSCs1的circRNA表達(dá)水平

3 討論

目前，手術(shù)根治性切除是胰腺癌最有效的治療方式，但大量的初診患者因為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而錯過了胰腺癌根治性手術(shù)的時機?；熀头暖熌壳耙彩侵委熞认侔┑姆桨钢?，但效果不佳。近年來，PSCs相關(guān)靶向藥物精準(zhǔn)化治療胰腺癌成為令人矚目的焦點，研究表明PSCs與胰腺癌細(xì)胞共同構(gòu)成了腫瘤發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境[5]。即胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以通過多種信號途徑來促進靜息態(tài)PSCs產(chǎn)生α-SMA和I型前膠原C肽，使PSCs活化為激活態(tài)PSCs[6]。而激活態(tài)PSCs可以迅速增殖并主動遷徙，同時分泌多種信號分子，如結(jié)締組織生長因子、TGF-β等 ，這些信號分子可以反過來作用于胰腺癌細(xì)胞，促進胰腺癌細(xì)胞生長、增殖和遷移[7-8]。PSCs不但能和胰腺癌細(xì)胞相互作用，還能與腫瘤微環(huán)境的其他細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等發(fā)生相互作用來促進胰腺癌的疾病進展[9-10]。由此可見，PSCs在胰腺癌的疾病進展中扮演著重要角色。因此，探明PSCs和胰腺癌細(xì)胞相互作用的具體機制可以為胰腺癌的靶向治療方案提供重要指導(dǎo)。

circRNA是一種具有組織特異性的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，且比線性RNA更為穩(wěn)定，并具有基因調(diào)控功能。目前，研究證實了circRNA在包括胰腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中有著不可替代的作用[11]，而且circRNA還與癌癥相關(guān)的microRNA存在著聯(lián)系，其以circRNA-microRNA調(diào)控軸的形式參與了癌癥發(fā)生和發(fā)展的過程[12]。但關(guān)于PSCs是否能通過circRNA-microRNA調(diào)控軸靶向調(diào)控胰腺癌腫瘤進展的研究則未有過報道。因此，本研究分離培養(yǎng)了不同來源的PSCs，然后通過將其與Panc-1細(xì)胞共培養(yǎng)來模擬胰腺癌背景下的細(xì)胞微環(huán)境。之后利用CCK-8實驗對共培養(yǎng)后的PSCs進行篩選，并最終得到了CaPSCs1和NaPSCs1。之后我們用RNA高通量測序分析并比較了這兩種細(xì)胞的RNA表達(dá)譜，得到了9 069個差異有統(tǒng)計學(xué)意義的基因。同時，為排除篩選數(shù)據(jù)假陽性的可能性，本研究選擇前3位差異性表達(dá)最大的circRNA：chr7:154954255|154998784、chr10:12081472|12120267以及chr10:76909966|77019099進行qRT-PCR驗證了其與測序結(jié)果一致，并用CeRNA網(wǎng)絡(luò)預(yù)測了其對應(yīng)的下游靶基因(microRNA)分別為hsa-miR-612、hsa-miR-1301-3p、hsa-miR-4459。這為建立PSCs相關(guān)的circRNA-microRNA調(diào)控通路提供了依據(jù)。本研究還將篩得的差異表達(dá)基因進行KEGG條目分析發(fā)現(xiàn)了差異基因富集的信號傳導(dǎo)通路為Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、HIF-1信號通路等。這一結(jié)果表明，差異表達(dá)基因可能直接或間接參與胰腺癌的增殖和侵襲的多種信號傳導(dǎo)環(huán)節(jié)，同時也說明人胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中基因調(diào)控改變的復(fù)雜性生物過程。KEGG生物過程則主要富集在細(xì)胞-底物連接和細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接等方面。研究[13]表明不同疾病環(huán)境中分離出的PSCs保持不同的表型是細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的結(jié)果。此外，Apte et al[14]證明了細(xì)胞外基質(zhì)的組成能影響PSCs基因的表達(dá)模式。Bynigeri et al[15]認(rèn)為PSCs-基質(zhì)，PSCs-底物之間的相互作用是動態(tài)的，即早期發(fā)揮抗癌作用，而在后期則產(chǎn)生促癌作用。因此，胰腺癌中PSCs相關(guān)的細(xì)胞-底物連接和細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接可以有助于闡明腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間相互作用的機制，這將為基質(zhì)靶向治療提供新的靶點。

綜上，本研究比較了從胰腺癌組織和正常胰腺組織中培養(yǎng)的原代CaPSCs1和NaPSCs1之間circRNA表達(dá)譜的差異，并對PSCs促進胰腺癌進展的circRNA-microRNA調(diào)控通路和差異基因富集的生物學(xué)途徑進行了初步探討。后續(xù)的研究將對胰腺癌細(xì)胞和正常胰腺細(xì)胞中circRNA表達(dá)譜的差異進行比較，同時進一步增加本研究的樣本量，并進行體外動物實驗以及細(xì)胞功能學(xué)實驗。