周海波，陳 炯，鄔高華，胡丕波，何俊飛

胰腺癌是一種惡性程度高的消化系統(tǒng)腫瘤，早期無特異性癥狀，大多數(shù)患者在臨床確診時(shí)已處于晚期階段，雖然目前胰腺癌的治療手段有了進(jìn)步，但其5年生存率僅有9%，胰腺癌已成為全球第7大致死癌癥[1-2]。CD155蛋白(又稱人類脊髓灰質(zhì)炎病毒受體，poliovirus receptor，PVR)是Nectin樣分子家族中的第5個(gè)成員，也屬于免疫球蛋白超家族成員，是DNAX輔助分子-1(DNAX accessory molecule-1，DNAM-1)的配體，研究表明其在結(jié)腸癌、肺癌多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等有關(guān)[3]。但是關(guān)于CD155蛋白的表達(dá)與胰腺癌組織之間的關(guān)系，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。該研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測胰腺導(dǎo)管腺癌及其癌旁組織中CD155蛋白的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理資料的關(guān)系，采用Western blot及qRT-PCR法分析胰腺正常細(xì)胞及胰腺癌細(xì)胞株中的CD155蛋白及mRNA的表達(dá)，旨在探討CD155表達(dá)與胰腺癌組織的相關(guān)性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料人正常胰腺細(xì)胞株HPDE6-C7及胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1、BxPC-3、AsPC-1(中科院上海細(xì)胞庫)。收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科在2016年1月～2019年10月間接收的實(shí)施根治性手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌的組織及其對應(yīng)的癌旁組織(距離癌組織 >2 cm)各92例。被研究者臨床資料完整，術(shù)前無放化療。其中：男56例，女36例；年齡40～79(61.43±9.05)歲，<60歲38例，≥60歲54例；胰頭癌、胰體尾癌分別為53、39例；高、中+低分化分別為35、57例；TNM分期參照AJCC分期第7版，其中Ⅰ～Ⅱ期54例,Ⅲ～Ⅳ 38例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移分別為50、42例；神經(jīng)侵犯55例，未被侵犯37例。本實(shí)驗(yàn)均得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)及患者的知情同意。

1.2 主要試劑胎牛血清(杭州四季青公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；CD155一抗(美國CST公司)；二抗、免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 胰腺正常細(xì)胞(HPDE6-C7)、胰腺癌細(xì)胞(BxPC-3、AsPC-1)使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，胰腺癌細(xì)胞(Panc-1)使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，4種細(xì)胞均靜置于37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)，2～3 d換液傳代。

1.3.2Western blot 從培養(yǎng)基中分別收取胰腺正常細(xì)胞及3株胰腺癌細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白，按照1 ∶4加入5×上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min冷卻后上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜; 5%脫脂奶粉封閉；滴加稀釋過的CD155一抗，4 ℃過夜；加入適當(dāng)稀釋度的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h后PBST洗滌3次，隨后加入ECL曝光顯影并使用Im-age J軟件進(jìn)行條帶分析。

1.3.3qRT-PCR 按照TRIzol試劑盒提取胰腺正常細(xì)胞及3株胰腺癌細(xì)胞的RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。使用qPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)體系為10 μl。以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′；CD155上游引物：5′-CCAGTGAGCACTCAGGTACA-3′，下游引物：5′-GTCTGTGGATCCTGGGAAGA-3′。采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3.4免疫組化 石蠟包埋標(biāo)本3 μm連續(xù)切片，脫蠟后檸檬酸鹽高壓修復(fù)，緩慢冷卻至室溫，然后使用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑消除內(nèi)源性過氧化物酶活性(30 min)，PBS沖洗3次，再滴加一抗CD155(1 ∶200)，4 ℃過夜，次日室溫下放置 30 min，PBS沖洗3次，隨后滴加二抗孵育30 min，PBS沖洗3次，加入適量DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，烘箱烘干，最后中性樹脂封片。

2 結(jié)果

2.1 CD155蛋白在正常胰腺細(xì)胞及3株胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)Western blot結(jié)果提示CD155蛋白在正常胰腺細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中均有表達(dá)，但是在胰腺正常細(xì)胞中表達(dá)較低，HPDE6-C7 、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3中CD155平均灰度值分別為(0.27±0.03)、(1.15±0.08)、(0.82±0.06)、(0.63±0.03)，四組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=135.99，P<0.01),在胰腺癌細(xì)胞中由低到高的順序?yàn)锽xPC-3、AsPC-1、Panc-1，與HPDE6-C7比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.59、15.50、17.08，P<0.01)。見圖1、2。

圖1 胰腺正常細(xì)胞和3株胰腺癌細(xì)胞中CD155蛋白表達(dá)情況

圖2 胰腺正常細(xì)胞和3株胰腺癌細(xì)胞中CD155蛋白表達(dá)量

2.2 CD155 mRNA在正常胰腺細(xì)胞及3株胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)差異PCR結(jié)果顯示CD155 mRNA在正常胰腺細(xì)胞及3株胰腺癌細(xì)胞均有表達(dá)，HPDE6-C7、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3中CD155 mRNA平均表達(dá)水平分別為(1.00±0.15)、(5.02±0.39)、(2.79±0.28)、(1.67±0.06)，四組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=295.82,P<0.05)。與正常胰腺細(xì)胞HPDE6-C7比較,胰腺癌細(xì)胞(BxPC-3、AsPC-1、Panc-1)中mRNA表達(dá)量均比正常胰腺細(xì)胞高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.38、14.13、17.08，P<0.01)，且mRNA結(jié)果與Western blot中CD155蛋白表達(dá)結(jié)果相一致。見圖3。

圖3 胰腺正常細(xì)胞和3株胰腺癌細(xì)胞中CD155 mRNA表達(dá)量

2.3 CD155蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌和癌旁正常組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示CD155蛋白主要表達(dá)在胰腺導(dǎo)管腺癌組織的細(xì)胞膜上，胰腺導(dǎo)管腺癌組織中陽性表達(dá)率為65.22%(60/92),癌旁組織中陽性表達(dá)率為38.04%(35/92)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.60，P<0.01)。見圖4。

圖4 CD155蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌和胰腺癌組織中表達(dá)情況 ×200

2.4 CD155蛋白的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床資料的相關(guān)性CD155蛋白的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌的分化程度、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=12.451、16.614、10.551，P<0.05),而與患者的性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期等無關(guān)。見表1。

表1 胰腺導(dǎo)管腺癌組織中CD155蛋白的表達(dá)與臨床病理關(guān)系 (n)

3 討論

DNAM-1(又稱DNAX輔助因子-1、CD226)是一種分子量為65 000的免疫球蛋白樣跨膜糖蛋白，可表達(dá)于NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和一部分B細(xì)胞的表面，CD155作為DNAM-1的配體，可分為膜表達(dá)型(mCD155)和可溶型(sCD155)兩種形式；有研究[3-5]報(bào)道DNAM-1受體與靶細(xì)胞膜表面配體CD155結(jié)合后可促使免疫細(xì)胞(如NK細(xì)胞、T細(xì)胞)活化，釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性分子并誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡，CD155由于其突出的免疫功能，最近在腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注，與健康組織相比，CD155在人類惡性腫瘤中高表達(dá)，可與活化或抑制性受體結(jié)合參與免疫功能調(diào)節(jié)。

CD155與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相連。Triki et al[6]對158例乳腺癌標(biāo)本通過免疫組化發(fā)現(xiàn)CD155在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，其主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞膜上CD155表達(dá)與NK細(xì)胞浸潤有關(guān)，并且細(xì)胞膜上高表達(dá)CD155的乳腺癌組織NK細(xì)胞浸潤的密度越高，相比較細(xì)胞膜上低表達(dá)CD155的乳腺癌患者，具有更好的預(yù)后和更高的生存率。Kearney et al[7]發(fā)現(xiàn)健康患者來源的NK細(xì)胞殺傷急性髓系白血病(AML)細(xì)胞需依賴CD155與DNAM-1的結(jié)合，當(dāng)AML細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)CD155時(shí)，不能促使NK細(xì)胞活化，降低了NK細(xì)胞裂解靶細(xì)胞的能力，而高表達(dá)CD155的AML細(xì)胞,NK細(xì)胞對其殺傷作用強(qiáng)，當(dāng)使用硼替佐米上調(diào)低CD155表達(dá)的AML細(xì)胞，增強(qiáng)了NK細(xì)胞殺傷AML細(xì)胞的殺傷能力，這表明CD155的表達(dá)高低直接影響到DNAM-1依賴的NK細(xì)胞對AML細(xì)胞的殺傷作用的強(qiáng)弱。雖然這些研究顯示CD155高表達(dá)是誘導(dǎo)腫瘤凋亡的有利因素，但是也有研究表明抑制CD155的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用。Zheng et al[8]用免疫組織化學(xué)方法檢測了97例結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織的CD155表達(dá)情況，結(jié)果表明CD155在結(jié)腸癌中的表達(dá)比癌旁組織高，同時(shí)Western-blot方法也證實(shí)了結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中CD155的高表達(dá)，分析與臨床病理間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)CD155的表達(dá)與結(jié)腸癌AJCC分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明CD155的過度表達(dá)與結(jié)腸癌的進(jìn)展有關(guān)，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究顯示CD155基因敲除能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，其可能通過上調(diào)促凋亡分子和抑制抗凋亡分子的表達(dá)而發(fā)揮作用。上述的這些研究結(jié)果表明CD155的表達(dá)在不同腫瘤中發(fā)揮著重要的免疫功能，CD155可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，這為治療胰腺癌提供了新思路，或許能夠調(diào)控CD155的表達(dá)來探索胰腺癌治療的新方法。

本研究通過免疫組化法檢測了92例胰腺導(dǎo)管腺癌組織和及其配對的癌旁正常組織中CD155的表達(dá)情況，結(jié)果顯示胰腺導(dǎo)管腺癌組織中CD155表達(dá)高于癌旁正常組織，主要表達(dá)于胰腺導(dǎo)管腺癌組織的細(xì)胞膜上。為了驗(yàn)證CD155在胰腺癌中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，本課題組設(shè)計(jì)了Western blot和qRT-PCR兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來檢測胰腺癌細(xì)胞系和正常胰腺細(xì)胞CD155的表達(dá)，結(jié)果顯示胰腺癌細(xì)胞系中CD155蛋白和mRNA水平均高于正常胰腺細(xì)胞，其結(jié)果與免疫組化的結(jié)果相一致。進(jìn)一步分析顯示CD155蛋白表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌的分化程度、神經(jīng)侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性，而與患者其它臨床資料無相關(guān)性。有研究[9-10]表明癌癥患者中DNAM-1受體表達(dá)降低或sCD155表達(dá)增加，降低了免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。Lee et al[11]發(fā)現(xiàn)雙陰性T細(xì)胞能通過DNAM-1與急性髓系白血病表面的CD155結(jié)合而發(fā)揮抗腫瘤作用，當(dāng)阻斷DNAM-1受體后，其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力降低。這表明DNAM-1與CD155的有效結(jié)合是免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的所依賴的途徑。根據(jù)這些研究者的發(fā)現(xiàn)，所以本研究推測胰腺癌患者中可能也出現(xiàn)DNAM-1的減少，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞不能充分與胰腺癌表面的高表達(dá)的CD155結(jié)合，或者因sCD155的增多，與mCD155競爭結(jié)合DNAM-1受體,使活化的免疫細(xì)胞減少，從而降低了對腫瘤細(xì)胞的殺傷，使得胰腺癌得以進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CD155在胰腺癌中的高表達(dá)可能與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在一定的相關(guān)性，CD155的檢測可能有助于評估胰腺癌患者的臨床病情。

綜上，本研究表明CD155蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)，且與胰腺導(dǎo)管腺癌的分化程度、神經(jīng)浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，這些結(jié)果提示CD155可能參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展，提示CD155可能是預(yù)測胰腺癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)因其的免疫功能，CD155有望成為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。課題組后期將通過體外細(xì)胞阻斷實(shí)驗(yàn)研究免疫細(xì)胞是否通過CD155/DNAM-1途徑殺傷胰腺癌細(xì)胞，進(jìn)一步闡述CD155高表達(dá)在胰腺癌中的作用。