茹曉宇，程傳東, 計(jì) 穎

膠質(zhì)瘤起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，世界衛(wèi)生組織將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的低級(jí)別膠質(zhì)瘤和Ⅲ～Ⅳ的高級(jí)別膠質(zhì)瘤，其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤占成人原發(fā)腦腫瘤75%[1]，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)屬于惡性程度極高的Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤，僅0.71%患者生存超過10年[2]，其致死率一直以來居中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之首，中位生存期在15個(gè)月左右，預(yù)后差[3]。脂肪細(xì)胞增強(qiáng)結(jié)合蛋白1(adipocyte enhancer-binding protein 1，AEBP1)最初被認(rèn)為是負(fù)性調(diào)節(jié)脂肪生成的轉(zhuǎn)錄抑制劑，是一新型炎癥調(diào)控因子。越來越多研究發(fā)現(xiàn)AEBP1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。如在胃癌、膀胱癌中AEBP1高表達(dá)且降低患者預(yù)后[4-6]。近期在結(jié)直腸癌組織中也發(fā)現(xiàn)AEBP1表達(dá)水平與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)，同時(shí)認(rèn)為AEBP1可能成為具有化療耐藥性的結(jié)直腸癌患者的一種新治療方法[7]。AEBP1在GBM中研究甚少，僅一篇2012年發(fā)表研究認(rèn)為在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中AEBP1基因抑制后，細(xì)胞增殖及存活能力受到影響，但AEBP1在GBM組織中表達(dá)水平、對(duì)患者預(yù)后等影響尚未有研究報(bào)道[8]。該研究擬通過對(duì)各類數(shù)據(jù)庫綜合挖掘，探究AEBP1在GBM中的表達(dá)水平及與各臨床病理特征的相關(guān)性，分析對(duì)患者預(yù)后的影響，并對(duì)AEBP1在GBM中可能的功能和作用信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測，以期從新的視角進(jìn)一步闡明GBM發(fā)生發(fā)展過程中的可能機(jī)制，為尋求GBM治療潛在的有效靶點(diǎn)，延長患者生存期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)是世界上目前最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，通過Oncomine數(shù)據(jù)庫，可比較腫瘤組織和其正常組織中mRNA的差異表達(dá)。設(shè)定的主要篩選條件為：① 基因：AEBP1；② 分析類型：腫瘤vs正常組織；③ 腫瘤類型：中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤；④ 數(shù)據(jù)類型：mRNA。以P≤0.05，差異倍數(shù)≥1.5，排名≥10%為閾值。

1.2 GEPIA網(wǎng)站分析GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)是由北京大學(xué)開發(fā)研究，整合TCGA、GTEx等數(shù)據(jù)庫信息的可視化網(wǎng)站[9]。通過該網(wǎng)站設(shè)置|log2FC|截?cái)嘀禐?，P截?cái)嘀禐?.01，再次分析AEBP1 mRNA在GBM中表達(dá)水平，進(jìn)一步利用該數(shù)據(jù)庫生存分析功能探究AEBP1表達(dá)水平對(duì)GBM患者整體生存期(overall survival，OS)和無進(jìn)展生存期(disease free survival，DFS)的影響。分組截?cái)嘀颠x擇中位數(shù)。

1.3 TCGA分析從TCGA數(shù)據(jù)庫(htps://www.cancer.gov/)中下載GBM患者的mRNA測序和臨床信息數(shù)據(jù)，異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase，IDH1)基因突變信息從cBioPortal數(shù)據(jù)庫下載。在R中使用edge R包對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理及篩選在GBM中差異表達(dá)的基因，以|log2FC|>1且調(diào)整后P<0.05為篩選閾值。以AEBP1 mRNA表達(dá)水平的中位值為界，將GBM患者分為高表達(dá)和低表達(dá)組，分析AEBP1 mRNA表達(dá)水平與各臨床病理特征相關(guān)性，最后行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，探究影響GBM患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1.4 人類蛋白圖譜分析人類蛋白質(zhì)圖譜(the human protein atlas，HPA) 主要是基于免疫組化分析的大型蛋白組數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)，可提供約26 000種人蛋白質(zhì)的在組織及細(xì)胞中的分布信息[10]。選擇數(shù)據(jù)庫中AEBP1抗體(CAB009966) 對(duì)正常大腦組織和膠質(zhì)瘤組織免疫組化檢測結(jié)果進(jìn)行分析，共包括3例正常腦組織和 12例膠質(zhì)瘤組織。

1.5 AEBP1及其共表達(dá)基因的GO和KEGG通路富集分析cBioPortal數(shù)據(jù)庫(http://www.cbioportal.org)是一個(gè)開放的分析癌癥基因數(shù)據(jù)的可視化工具，可進(jìn)行多維度癌癥基因集數(shù)據(jù)的探索。利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫Co-expression模塊在“Glioblastoma TCGA cell 2013”數(shù)據(jù)集中找出與AEBP1共表達(dá)的817個(gè)基因(Spearmans相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值≥0.4)。隨后將AEBP1及其共表達(dá)817個(gè)基因上傳至WebGestalt 網(wǎng)站(http://www.webgestalt.org/option.php)行GO與KEGG通路富集分析，WebGestalt網(wǎng)站是GO功能注釋及KEGG通路富集分析一在線工具，更新及時(shí)，包涵較為全面的功能注釋數(shù)據(jù)庫。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Oncomine數(shù)據(jù)庫和GEPIA網(wǎng)站分析中的兩組間比較采用t檢驗(yàn)。AEBP1表達(dá)水平對(duì)OS和DFS影響采用Kaplan-Meier(K-M)生存曲線進(jìn)行分析，χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析AEBP1表達(dá)水平與GBM各臨床病理特征相關(guān)性，在R中利用Survival包行多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AEBP1 mRNA在GBM組織中表達(dá)水平根據(jù)設(shè)定條件，共篩選出11項(xiàng)數(shù)據(jù)集，排除非GBM的數(shù)據(jù)集，最終納入7項(xiàng)數(shù)據(jù)集包含AEBP1 mRNA在GBM中表達(dá)。結(jié)果7項(xiàng)數(shù)據(jù)集中均顯示AEBP1 mRNA在GBM組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1A～G。進(jìn)一步在GEPIA網(wǎng)站分析顯示，GBM組(n=163)較正常組(n=207)高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1H。

2.2 GEPIA網(wǎng)站分析AEBP1 mRNA表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后影響利用GEPIA網(wǎng)站繪制 K-M生存曲線顯示，對(duì)162例GBM患者分析，AEBP1 mRNA高表達(dá)患者(n=81)OS低于低表達(dá)患者(n=81)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=3.9×10-5)，見圖2A,且高表達(dá)患者有降低DFS趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.086)(圖2B)。

2.3 AEBP1 mRNA表達(dá)水平與臨床各病理特征的相關(guān)性從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載了588例GBM患者的mRNA測序數(shù)據(jù)，根據(jù)設(shè)置條件通過edge R包得到了236個(gè)差異表達(dá)基因，其中AEBP1是GBM患者中上調(diào)基因(log2 FC=2.813 076,P=4.75×10-5)。進(jìn)一步篩選出同時(shí)有AEBP1 mRNA表達(dá)值和完整臨床信息的病例總計(jì)160例，對(duì)AEBP1 mRNA表達(dá)與GBM各臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明AEBP1 mRNA表達(dá)在不同性別、年齡、種族、術(shù)后是否行放療或化療以及KPS評(píng)分高低組中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，但AEBP1 mRNA的表達(dá)與患者是否存在IDH1突變相關(guān)(P=0.005)，見表1。

2.4 AEBP1 mRNA表達(dá)水平是GBM患者的獨(dú)立預(yù)后因素單因素分析發(fā)現(xiàn)AEBP1 mRNA的高表達(dá)(P=1.99×10-4)、術(shù)后未行放療(P=4.5×10-7)、術(shù)后未行化療(P=1.35×10-4)以及IDH1基因野生型(P=8.73×10-3)降低患者OS，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，年齡、性別、種族和KPS評(píng)分與患者預(yù)后無相關(guān)性(P>0.05)。隨后將上述P<0.05的因素納入多因素的Cox回歸模型中行進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示AEBP1 mRNA的高表達(dá)(HR=0.563 1(0.390 2，0.812 7)，P=2.16×10-3)和放療(HR=3.925 5(1.559 6，9.880 6)，P=3.69×10-3)均是患者OS的獨(dú)立影響因素，見表2。

2.5 AEBP1蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平為了進(jìn)一步在蛋白水平證實(shí)AEBP1在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)，在HPA數(shù)據(jù)庫中IHC信息發(fā)現(xiàn)在3例正常腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均未見表達(dá)，見圖3A，12例膠質(zhì)瘤中有4例顯示AEBP1蛋白陽性表達(dá)，其中高級(jí)別膠質(zhì)瘤陽性3例, 低級(jí)別膠質(zhì)瘤陽性1例(圖3B)。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AEBP1蛋白在膠質(zhì)瘤組織中陽性表達(dá)。

圖1 AEBP1 mRNA在GBM患者中表達(dá)上調(diào)

圖2 AEBP1 mRNA表達(dá)水平對(duì)GBM患者OS(A)和DFS(B)影響

2.6 AEBP1及其共表達(dá)基因的GO和KEGG通路富集分析對(duì)AEBP1及其共表達(dá)的817個(gè)基因進(jìn)行GO功能富集分析，包括分子功能(molecular function，MF)，生物過程(biological process，BP)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)三個(gè)部分。結(jié)果顯示這些基因涉及的生物學(xué)過程主要為生物調(diào)節(jié)、代謝過程以及細(xì)胞增殖、繁殖、生長等；細(xì)胞組分分類中主要集中在細(xì)胞膜、細(xì)胞核等；涉及的分子功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等功能，見圖4A。對(duì)AEBP1及其共表達(dá)的817個(gè)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，以直方展示了富集的前10條通路，可見富集比最高的通路為Hippo信號(hào)通路，其次是NF-κB 、TNF信號(hào)通路等，見圖4B。

圖3 AEBP1蛋白在正常腦組織(A)和膠質(zhì)瘤(B)中表達(dá)的IHC染色代表性圖片

表1 GBM患者AEBP1表達(dá)水平與各臨床參數(shù)的相關(guān)性(n)

3 討論

GBM是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方式主要為手術(shù)切除，緩解顱內(nèi)高壓和壓迫引起癥狀，術(shù)后放療同步聯(lián)合替莫唑胺輔助化療。有限的治療手段目前不能滿足臨床治療的需求，GBM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍尚不清楚，故對(duì)關(guān)鍵腫瘤標(biāo)志物的識(shí)別可助于膠質(zhì)瘤的診斷及個(gè)性化治療。本研究擬通過生物信息分析探究AEBP1在GBM患者中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后等影響，并預(yù)測AEBP1發(fā)揮作用的可能機(jī)制。

Oncomine數(shù)據(jù)庫篩選出的7項(xiàng)數(shù)據(jù)集均顯示相對(duì)正常的腦組織，GBM組織中AEBP1 mRNA過表達(dá)，且基因差異倍數(shù)均大于1.5，其中l(wèi)iang數(shù)據(jù)集差異倍數(shù)高達(dá)10.017，進(jìn)一步GEPIA網(wǎng)站分析再次證實(shí)AEBP1的高表達(dá)。該結(jié)果是基于Oncomine這一大型綜合數(shù)據(jù)庫和GEPIA網(wǎng)站分析所得結(jié)論，結(jié)果可信度高，對(duì)后續(xù)的研究驗(yàn)證具有重要的參考意義。利用HPA數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步證實(shí)AEBP1蛋白在膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)，且隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的提高，AEBP1的陽性率也隨之提高，但所納入樣本量較少。下一步研究擬對(duì)大樣本GBM患者組織行IHC染色，進(jìn)一步研究AEBP1蛋白在GBM中表達(dá)及臨床意義。

表2 影響GBM患者OS的單因素和多因素Cox回歸分析

圖4 AEBP1及其共表達(dá)基因的(A)GO(MF、BP、CC)和(B)KEGG通路富集分析直方圖

GEPIA網(wǎng)站進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)AEBP1 mRNA過表達(dá)降低GBM患者OS，其DFS也有降低的趨勢。為進(jìn)一步探究AEBP1 mRNA高表達(dá)在GBM中的臨床意義，下載了TCGA數(shù)據(jù)庫中160例GBM 患者AEBP1 mRNA表達(dá)值及對(duì)應(yīng)臨床資料，分析發(fā)現(xiàn)AEBP1 mRNA表達(dá)在不同性別、年齡、種族、術(shù)后是否行放療或化療以及KPS評(píng)分高低組中均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但卻發(fā)現(xiàn)與患者是否存在IDH1突變有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。這一結(jié)論值得進(jìn)一步深入探討分析。隨后行Cox生存回歸分析，單因素分析發(fā)現(xiàn)AEBP1 mRNA的表達(dá)水平、術(shù)后是否行放療或化療以及IDH1基因突變與否影響患者OS，多因素分析顯示AEBP1 mRNA表達(dá)水平及術(shù)后是否行放療是獨(dú)立的預(yù)后影響因素。這是目前首次報(bào)道AEBP1表達(dá)是GBM患者的獨(dú)立預(yù)后因子。該結(jié)果提示AEBP1參與了GBM的疾病進(jìn)展的過程，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的GBM標(biāo)志物，驗(yàn)證疾病的相關(guān)機(jī)制和提出新的假設(shè)提供了新的機(jī)會(huì)。類似的，近期在結(jié)腸腺癌一項(xiàng)研究，單因素與多因素Cox回歸分析也發(fā)現(xiàn)AEBP1高表達(dá)降低患者OS[11]。多項(xiàng)研究已證實(shí)IDH1突變可見于GBM，可明顯改善患者預(yù)后, 是更有利生存結(jié)局的重要預(yù)測因子[12]。本研究單因素分析同樣證實(shí)IDH1突變患者OS增加，但多因素未證實(shí)IDHI突變狀態(tài)是GBM的獨(dú)立預(yù)后因子，可能與本研究納入Cox回歸模型分析的因素有關(guān)。

本研究也對(duì)AEBP1在GBM中的功能及可能參與信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測。通過GO功能注釋發(fā)現(xiàn)AEBP1主要涉及生物調(diào)節(jié)、代謝過程以及腫瘤相關(guān)細(xì)胞增殖、繁殖、生長等生物學(xué)過程。KEGG通路富集分析排列前三位通路的分別是Hippo、NF-κB及TNF信號(hào)通路。其中NF-κB通路在GBM的重要作用近期發(fā)表在Cell上的一篇綜述再次被強(qiáng)調(diào)[13]，AEBP1通過NF-κB信號(hào)通路在多種疾病中發(fā)揮作用已被研究報(bào)道，包括胃癌[4]，結(jié)腸腺癌[11]等腫瘤。 在GBM中AEBP1是否通過NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用及其具體的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。