沈鴻濤，劉 雪，吳婷婷，竇仁剛，吳建賢，洪永鋒

近年來(lái)流行病學(xué)資料表明[1]，我國(guó)腦血管病的發(fā)病率和死亡率明顯高于心血管病，系居首位的人口死亡原因。腦血管病中，以缺血性腦卒中最為多見。缺血性腦卒中是指因腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧所導(dǎo)致的局限性腦組織缺血性壞死或軟化。腦缺血后引起腦組織的炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性神經(jīng)損傷的重要機(jī)制[1]。腦組織缺血后的炎癥反應(yīng)主要是由于腦細(xì)胞釋放大量腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor，TNF-α)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，此過(guò)程不僅是引起腦缺血患者各種功能障礙的基礎(chǔ)，也是影響患者預(yù)后的主要因素之一[2-4]。

鐵皮石斛作為傳統(tǒng)的名貴中藥，具有十分有效的藥用和保健價(jià)值。鐵皮石斛多糖(dendrobium of polysaccharide，DOP)為鐵皮石斛最主要的成分，鐵皮石斛所含多糖成分是其它類石斛的數(shù)倍。已有研究[5]表明DOP具有抗炎、提高機(jī)體免疫能力的作用。而對(duì)于缺血性腦卒中，腦組織的炎癥反應(yīng)所引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致各種功能障礙的基礎(chǔ)。因此，探究DOP抑制腦組織炎癥引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用具有重要的潛在價(jià)值[6]。

該實(shí)驗(yàn)的目的是為了探討傳統(tǒng)中藥成分DOP是否具有抑制由TNF-α引起的HT22神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用，并找出其作用的最佳濃度，旨在為臨床治療缺血性腦卒中并改善其預(yù)后提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng)本研究使用的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系(HT22)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。該細(xì)胞系是體外研究谷氨酸毒性的良好模型，在很多神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茲海默病(alzheimer's disease,AD)和帕金森病(parkinson's disease,PD)的研究中均有很好應(yīng)用[6]。細(xì)胞按照3×105個(gè)細(xì)胞數(shù)種于六孔板中，分別設(shè)置正常培養(yǎng)組、不同濃度TNF-α組、加入不同濃度DOP共同培養(yǎng)組。

1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基與胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；β-actin、p53、caspase-3、BAX引物購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；β-actin、p53、caspase-3、BAX單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；Annexin V/PI雙染試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；蛋白提取試劑盒、吉姆薩染色液、Hoechst染色液購(gòu)自中國(guó)上海碧云天公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1熒光定量PCR 用Trizol試劑提取和純化總RNA。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；條件如下：在95 ℃下變性15 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)包括：95 ℃、10 s，53 ℃、30 s，之后4 ℃冷卻5 min。最后采用2-ΔΔCt方法用于比較每組中標(biāo)志物的基因表達(dá)。所有PCR一式三份進(jìn)行，并通過(guò)熔解曲線對(duì)單峰的存在進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.2Western blot 體外培養(yǎng)HT22細(xì)胞，按照預(yù)設(shè)分組培養(yǎng)。用含有蛋白酶/磷酸酶抑制劑和苯基甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA緩沖液在冰上裂解收集的細(xì)胞。裂解時(shí)間20 min，然后將樣品轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，并以12 000 r/min在4 ℃下離心15 min。將上清液小心地轉(zhuǎn)移到新管中并在-20 ℃下保存直至進(jìn)一步使用。使用二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量各個(gè)分組中蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品(各30 μg)電解并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，其在室溫下用含有0.2% Tween-20的5%脫脂奶粉封閉1～2 h。輕輕搖動(dòng)后，洗滌5次(每次8 min)，然后分別加入兔抗鼠p53單克隆抗體(1 ∶1 000)，兔抗鼠caspase-3單克隆抗體(1 ∶1 000)，兔抗鼠BAX單克隆抗體(1 ∶1 000)，在4 ℃過(guò)夜，將膜與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h。使用ECL advance Western blot檢測(cè)試劑盒檢測(cè)黑暗中的化學(xué)發(fā)光。

1.3.3CCK-8實(shí)驗(yàn) 在96孔板中接種3×103個(gè)HT22細(xì)胞過(guò)夜，然后設(shè)置5 ng/ml TNF-α組和正常培養(yǎng)組，孵育12、24、48 h后，每孔加入10 μl CCK-8檢測(cè)液，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比，使用酶標(biāo)儀在450 mm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD值)，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

1.3.4吉姆薩染色 體外培養(yǎng)HT22細(xì)胞，按照預(yù)設(shè)分組在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，然后PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，將按說(shuō)明書配制好的吉姆薩染液加入6孔板中，覆蓋細(xì)胞，染色15～30 min，吸去染液，用中性蒸餾水緩慢沖洗至出現(xiàn)淡藍(lán)色即可，鏡下觀察。正常細(xì)胞淡染藍(lán)色，凋亡細(xì)胞則深染藍(lán)色。

1.3.5Hoechst染色 體外培養(yǎng)HT22細(xì)胞，按照預(yù)設(shè)分組在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，然后PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，將Hoechst 33258染色液加入6孔板中，覆蓋細(xì)胞，染色10 min，吸去染液，PBS洗3次，每次5 min，超凈臺(tái)中避風(fēng)風(fēng)干，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。Hoechst 33258的最大激發(fā)波長(zhǎng)為346 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長(zhǎng)為352 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為461 nm。正常細(xì)胞細(xì)胞核呈均勻藍(lán)染，形狀規(guī)則且完整，凋亡細(xì)胞的胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染和半月形凝聚。

1.3.6Tunel染色 按照預(yù)設(shè)分組將細(xì)胞在細(xì)胞爬片上進(jìn)行培養(yǎng)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，然后PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2%的Triton X-100中處理5 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，從標(biāo)記液( vial 2: Label Solution)中吸出100 μl用于2個(gè)陰性對(duì)照( 50 μl/ 個(gè))，將50 μl酶緩沖液(vial 1: Enzyme Solution)加入到剩余450 μl的標(biāo)記液中充分混合均勻，得到500 μl Tunel反應(yīng)液(50 μl/樣本)，往樣品上滴加Tunel反應(yīng)液(覆蓋整個(gè)樣品)，陰性對(duì)照加標(biāo)記液，濕盒中37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，抗熒光淬滅封片液封片，用熒光倒置顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡(confocal)檢測(cè)。正常細(xì)胞被4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞為綠色。

1.3.7Annexin V/PI凋亡流式細(xì)胞術(shù) 體外培養(yǎng)HT22細(xì)胞，按照預(yù)設(shè)分組在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，于室溫2 000 r/min離心5～10 min，收集細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)不少于1×105個(gè)，用預(yù)冷1×PBS(4 ℃)重懸細(xì)胞一次，2 000 r/min離心5～10 min，洗滌細(xì)胞，加入400 μl 的1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min再加入5 μl的PI染色，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 5 ng/ml TNF-α為誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生凋亡的最佳濃度PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加入不同濃度(2.5、5、10、20 ng/ml)TNF-α培養(yǎng)HT22細(xì)胞24 h后：與正常培養(yǎng)組比較，凋亡相關(guān)基因(p53、caspase-3、BAX)的表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中5 ng/ml TNF-α組與其余濃度TNF-α組比較誘導(dǎo)HT22細(xì)胞發(fā)生凋亡的效果最為顯著(圖1A)。同時(shí)，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5 ng/ml TNF-α可以抑制HT22神經(jīng)細(xì)胞的增殖，且在加入TNF-α后培養(yǎng)12 h時(shí)的抑制效果最佳(圖1B、1C)，此時(shí)與正常培養(yǎng)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，此后其對(duì)HT22細(xì)胞增值的抑制作用逐漸減弱，至24 h時(shí)，TNF-α組中HT22細(xì)胞的增殖與正常培養(yǎng)組間已無(wú)明顯差異(P>0.05)。

圖1 TNF-α誘導(dǎo)HT22細(xì)胞凋亡PCR檢測(cè)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

圖2 DOP抑制HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的作用檢測(cè)

2.2 DOP可以抑制由TNF-α引起的HT22細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)分別將不同濃度(10、15、20、25、30 μg/ml)的DOP與5 ng/ml TNF-α共同培養(yǎng)HT22細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立5 ng/ml TNF-α培養(yǎng)組、正常培養(yǎng)組。培養(yǎng)24 h后，與正常培養(yǎng)組比較，5 ng/ml TNF-α組凋亡相關(guān)基因(p53、caspase-3、BAX)的表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；與5 ng/ml TNF-α組比較，除了15 μg/ml DOP組p53的表達(dá)量降低無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其余DOP組p53、caspase-3、BAX凋亡基因的表達(dá)均被抑制(P<0.05)，其中在20、25 μg/ml DOP濃度下，抑制效果最佳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A)。Western blot結(jié)果(圖2B)表明，與正常培養(yǎng)組比較，在加入5 ng/ml TNF-α后，凋亡相關(guān)蛋白p53、caspase-3、BAX的表達(dá)水平均升高(P<0.01)；與5 ng/ml TNF-α組比較，p53、caspase-3、BAX蛋白的表達(dá)均可被20、25 μg/ml DOP抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 DOP可顯著減少由TNF-α引起的HT22細(xì)胞凋亡數(shù)量吉姆薩染色結(jié)果(圖3A)顯示，加入5 ng/ml TNF-α后，深染凋亡細(xì)胞數(shù)量較正常培養(yǎng)組增多；與5 ng/ml TNF-α組比較，分別加入20、25 μg/ml DOP后，深染凋亡細(xì)胞數(shù)量均減少。Hoechst染色結(jié)果(圖3B)表明，與正常培養(yǎng)組比較，5 ng/ml TNF-α培養(yǎng)HT22細(xì)胞24 h后，藍(lán)色深染細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；分別加入20、25 μg/ml DOP后，其凋亡細(xì)胞的數(shù)量與5 ng/ml TNF-α組比較均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。Tunel染色結(jié)果(圖3C)顯示，與正常培養(yǎng)組比較，5 ng/ml TNF-α組綠色凋亡細(xì)胞增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；與5 ng/ml TNF-α組比較，分別加入20、25 μg/ml DOP 后，綠色凋亡細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Annexin V/PI凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(圖3D)表明，在加入5 ng/ml TNF-α后，HT22細(xì)胞的凋亡比例可達(dá)到29.74%，而正常培養(yǎng)組僅為6.97%，說(shuō)明TNF-α可以增加HT22細(xì)胞的凋亡比例；在分別加入20、25 μg/ml DOP后，HT22細(xì)胞的凋亡比例分別為22.80%和24.48%，均較5 ng/ml TNF-α組的凋亡比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明濃度為20、25 μg/ml的DOP均可抑制由TNF-α引起的HT22細(xì)胞凋亡。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)及不同染色方法檢測(cè)HT22細(xì)胞凋亡數(shù)量和比例

3 討論

患者發(fā)生缺血性腦卒中時(shí)，由于大腦局部的缺血或缺氧等原因引起腦組織的炎癥反應(yīng)進(jìn)而受損、壞死。TNF-α是引發(fā)腦組織炎癥的主要細(xì)胞因子之一[7]。在缺血性腦卒中后的急性期與恢復(fù)期，由于炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞不但自身會(huì)失去原有功能，并可阻斷細(xì)胞間的信號(hào)連接，從而加重缺血性腦卒中患者的各種功能障礙，并阻礙神經(jīng)功能的恢復(fù)。臨床上，缺血性腦卒中患者將會(huì)表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)與感覺障礙、失語(yǔ)、吞咽困難、認(rèn)知障礙等，并且恢復(fù)緩慢或難以恢復(fù)[8-9]。因此，有效抑制由TNF-α引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)改善缺血性腦卒中的功能預(yù)后有著重要臨床意義[10-11]。

本研究在加入不同濃度(2.5、5、10、20 ng/ml)的TNF-α培養(yǎng)HT22細(xì)胞24 h后，HT22細(xì)胞內(nèi)p53、caspase-3、BAX凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的升高，該結(jié)果證實(shí)了TNF-α的確可導(dǎo)致HT22神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且其機(jī)制為促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[12]。其中以5 ng/ml TNF-α引起HT22神經(jīng)細(xì)胞凋亡的效果最佳，而非更高的濃度，其原因考慮為：在10 ng/ml或20 ng/ml濃度的TNF-α作用下，HT22神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性，細(xì)胞直接死亡，而非啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的凋亡程序。另外，本研究以5 ng/ml的TNF-α對(duì)HT22細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)此濃度的TNF-α對(duì)HT22細(xì)胞的增殖亦有抑制作用，且在加入TNF-α培養(yǎng)12 h的抑制效果達(dá)到最大，此后這種抑制效果逐漸減弱，至培養(yǎng)24 h抑制增殖的效果已消失，分析這可能與細(xì)胞系的連續(xù)性傳代特性有關(guān)[13]。

本實(shí)驗(yàn)以TNF-α培養(yǎng)HT22細(xì)胞的同時(shí)，加入不同濃度(10、15、20、25、30 μg/ml)的DOP共培養(yǎng)HT22細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與TNF-α組比較，除了15 μg/ml DOP組HT22細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá)下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余濃度的DOP組3種凋亡基因(p53、caspase-3、BAX)的表達(dá)均呈降低趨勢(shì)，其中，以20、25 μg/ml DOP組的降低最為顯著。進(jìn)而，本研究采用20、25 μg/ml的DOP為實(shí)驗(yàn)濃度，對(duì)HT22細(xì)胞內(nèi)3種凋亡基因(p53、caspase-3、BAX)的蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果與3種基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果完全一致，即p53、caspase-3、BAX蛋白的表達(dá)亦被20、25 μg/ml DOP抑制。同時(shí)，吉姆薩染色、Hoechst染色、Tunel染色的結(jié)果均表明，在加入5 ng/ml TNF-α后，HT22凋亡細(xì)胞的數(shù)量增多，但這種現(xiàn)象在同時(shí)加入20、25 μg/ml DOP后得到了抑制。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，正常培養(yǎng)24 h時(shí)HT22凋亡細(xì)胞僅占6.97%；在加入5 ng/ml TNF-α后，HT22細(xì)胞的凋亡比例高達(dá)29.74%；但在加入20、25 μg/ml DOP后，HT22細(xì)胞的凋亡比例分別下降至22.80%和24.48% 。

TNF-α通常由兩種方式引起細(xì)胞凋亡，一種方式為作用于細(xì)胞膜上的TNF-R1受體，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)caspase-8的表達(dá)量，caspase-8作為caspase家族中的重要一員，它可通過(guò)上調(diào)caspase-3的表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡程序，引起細(xì)胞凋亡[14]；另一種方式是TNF-α作用于細(xì)胞膜上TNF-R2受體，激活細(xì)胞內(nèi)的NIK(誘導(dǎo)激酶)，誘導(dǎo)細(xì)胞上調(diào)NF-κB的表達(dá)，NF-κB的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)會(huì)引發(fā)凋亡基因p53的表達(dá)增加，從而引起細(xì)胞凋亡。BAX作為Bck-2家族中的重要促凋亡基因，BAX與Bcl-2的比例關(guān)系決定了細(xì)胞抑制凋亡作用的強(qiáng)弱[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致表明DOP具有對(duì)抗TNF-α引起的HT22細(xì)胞損傷、凋亡作用，且其發(fā)揮作用的機(jī)制可能與抑制了3種凋亡基因(p53、Caspase-3、BAX)的活化與表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)基因、蛋白以及HT22凋亡細(xì)胞數(shù)量和比例等的系列檢測(cè)，證實(shí)了TNF-α可以引起HT22神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，且5 ng/ml TNF-α系最佳的作用濃度。同時(shí)，DOP作為一種歷史悠久的名貴中草藥，在對(duì)抗由TNF-α引起的HT22神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面有著積極而顯著的作用，這為改善缺血性腦卒中預(yù)后的進(jìn)一步研究提供了新思路。然而，本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于未能揭示DOP抑制TNF-α引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的具體作用方式，今后將會(huì)繼續(xù)探討。