曹一凡，張如通，茍雅雯，陳樂樂，陳 思，張開光

胃癌是消化系統(tǒng)常見的腫瘤之一,胃癌的發(fā)病率和死亡率均位于我國惡性腫瘤的前五位[1]。盡管胃癌的診斷和治療在近年取得較多進展，但是治療和診斷的形勢依然嚴峻，其中主要原因之一就是其發(fā)病的分子機制較為復雜，尚不明確，這也是目前胃癌研究的熱點之一。

PHF5A(plant homodomain finger-like domain-containing protein 5A)是一種在真核生物中高度保守的蛋白。對于真核細胞，選擇性剪接和腫瘤的發(fā)生可能有一定的關系[2]。早先的研究報道，PHF5A可與剪接小體中的U2 snRNP復合物及依賴ATP的解旋酶超家族相互作用，可能作為不同基因的通用轉錄調(diào)控因子發(fā)揮作用[3-4]。近些年的研究顯示PHF5A蛋白參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，對腫瘤細胞干性、細胞周期調(diào)控、代謝、信號轉導等生物學過程均有影響[5-9]，但其表達異常與胃腺癌之間的關系尚無相關研究。該文旨在探究PHF5A在胃癌的表達情況及其對胃癌細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)胃癌細胞系MGC803、MKN45購自北京協(xié)和細胞資源中心；胃癌細胞系AGS購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；胃正常上皮細胞GES-1由中國人民解放軍大學樊代明課題組惠贈；MKN45和GES-1細胞在補充10%胎牛血清(美國Gibco公司)和1%青霉素-鏈霉素混合物(上海碧云天公司)的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；MGC803和AGS分別在補充同樣血清和青-鏈霉素的DMEM(美國GIBCO公司)和F12(美國Sigma公司)培養(yǎng)。所有細胞均置于5%CO2、37 ℃的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 qPCR法檢測PHF5A在細胞系中的mRNA表達水平用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取GES-1、MKN45、MGC803、AGS細胞總RNA，根據(jù)制造商的說明書使用逆轉錄試劑盒(南京Vazyme公司，R123-01)逆轉錄為cDNA，用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(南京Vazyme公司，Q11-02)進行所有qPCR中的 mRNA定量分析，以β-actin作為內(nèi)參照。使用引物如下：PHF5A上游引物為5′- GCACTCTGGTGCGCATATGTGA-3′，下游引物為5′- GACAATCTTTGGGCAGCCATCTC-3′；β-actin上游引物為5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3，下游引物為5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(上海生工生物工程公司)。每組設置3個復孔。運用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.3 Western blot法檢測PHF5A在細胞系中的蛋白表達水平選取處于對數(shù)生長期的GES-1、MKN45、MGC803、AGS細胞，棄上清液，用預冷的PBS洗3次，加入200 μl含1% PMSF(上海碧云天公司)和1%蛋白酶抑制劑(美國Sigma公司)的細胞裂解液并用細胞刮刀在冰上刮取細胞，轉移至1.5 ml離心管中并置于冰上裂解30 min，13 000 r/min,4 ℃離心15 min，吸取上清液提取總蛋白。使用Bradford(上海生工生物工程公司)依據(jù)說明書用酶標儀測量蛋白濃度并繪制標準曲線，計算蛋白濃度。取總蛋白量相同樣品，用PBS補充至相同體積并加入對應量的loading buffer混合，在95 ℃金屬浴中煮沸15 min使蛋白變性，-20 ℃保存。制備12%的聚丙烯酰胺凝膠，以β-actin (武漢三鷹生物公司,1 ∶1 000)作為內(nèi)參，加入蛋白并電泳，以濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將膜放入1%BSA稀釋的對應的抗體中,4 ℃冰箱內(nèi)封閉過夜。次日用TBST于搖床上搖晃清洗3次，每次10 min。二抗室溫孵育1 h后再用TBST清洗3次，用ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Advansta公司)顯影，最后用Image J 圖像處理系統(tǒng)分析并對圖像進行半定量。

1.4 慢病毒敲低PHF5A對照/實驗細胞系的建立采用HEK293T細胞包裝慢病毒并感染目的細胞。實驗使用的空載及敲低質(zhì)粒從中國科學技術大學生命科學院Human shRNA library獲取，PHF5A所選用兩種不同的敲低序列分別為sh1：5′-CCGGGCCTAC TACTACCAGCAGAAACTCGAGTTTCTGCTGGTAGTA GTAGGCTTTTTG-3′；sh2:5′-CCGGTGTGTGATTTGT GACTCCTATCTCGAGATAGGAGTCACAAATCACACA TTTTTG-3′。實驗中設置3組，轉染PLKO.1空載質(zhì)粒的細胞為陰性對照組，命名為sh-NC組，轉染PLKO.1-ShPHF5A-sh1質(zhì)粒的命名為sh1組，轉染PLKO.1-ShPHF5A-sh2質(zhì)粒的命名為sh2組，sh1和sh2作為實驗組。配置182 μl無血清DMEM和18 μl PEI混合物并加入1.5 μg包裝質(zhì)粒pMD2G和psPAX2以及3.0 μg目的shRNA，靜置后滴加至密度為60%左右的HEK293T細胞中，4 h后更換新鮮培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育2 d，收集含有病毒的上清液，用0.22 μm無菌濾器過濾后用以培養(yǎng)待感染的密度為60%左右的MGC803細胞中并加入8 μg/ml聚凝胺充分混合，在培養(yǎng)箱中孵育1 d后，用PBS溫和的洗滌目的細胞并更換新鮮的培養(yǎng)基，24 h后加入嘌呤霉素篩選。

1.5 Western blot法檢測敲低質(zhì)粒轉染后胃癌MGC803細胞系中PHF5A的表達水平取篩選后的生長狀態(tài)良好的細胞，以β-actin為內(nèi)參，按照“1.3項”中的方法檢測細胞中PHF5A(1 ∶1 000，武漢三鷹生物公司,15554-1-AP)蛋白表達水平。

1.6 克隆形成實驗取生長狀態(tài)良好的篩選后的對照組和實驗組細胞，用預熱的PBS洗去漂浮細胞，用胰酶(上海碧云天公司)37 ℃消化3 min，1 200 r/min、3 min離心并重懸后吹打成均勻的細胞懸液，在血球計數(shù)板上計數(shù)。以每孔5 000個細胞鋪于6孔板，并搖晃使細胞在孔中均勻分布，后小心移至培養(yǎng)箱。10 d后取出6孔板，棄上清液，PBS清洗后用4%甲醛固定15 min，用1%結晶紫染色15 min，用PBS清洗后拍照，并在鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)超過100個細胞的克隆形成的數(shù)量。

1.7 細胞生長曲線計數(shù)取生長狀態(tài)良好的篩選后的陰性對照和實驗組細胞，用預熱PBS洗去漂浮細胞，用胰酶消化并離心重懸吹打成均勻的細胞懸液，在血球計數(shù)板上計數(shù)。以每孔15 000個細胞將細胞鋪在12孔板中，每孔補培養(yǎng)基至1 ml。自第2天起每天取陰性對照組及實驗組sh1、sh2對應的孔各2個，消化細胞后再用400 μl PBS將對應的孔吹打清洗3次并在鏡下觀察孔中無殘余細胞，以保證所有細胞均被收集。將消化后的細胞懸液及對應PBS一起離心并用1 ml PBS重懸，用血球計數(shù)板計數(shù)并計算對應孔細胞密度，每組2個孔分別計數(shù)2次取均值，共計數(shù)5 d。繪制陰性對照和實驗組的生長曲線。

1.8 細胞劃痕實驗取生長狀態(tài)良好的篩選后的陰性對照和實驗組細胞，用胰酶消化并離心重懸吹打成均勻的細胞懸液，在血球計數(shù)板上計數(shù)。取每孔750 000個細胞，將細胞鋪在6孔板中，待細胞貼壁。用200 μl移液槍槍頭在培養(yǎng)板上劃十字，棄培養(yǎng)基并用PBS沖洗，去除漂浮細胞，加入無血清培養(yǎng)基。在0、6、12、24 h后在顯微鏡下觀察細胞遷移愈合情況并拍照，用Image J軟件進行半定量評價其遷移能力。

1.9 Western blot法檢測對照組和實驗組中NF-κB P65、IκBα、p-IκBα和Cyclin D1蛋白表達水平測量細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達水平需提取核蛋白，蛋白提取取用狀態(tài)良好的篩選后的陰性對照和實驗組細胞，用PBS洗1次，用細胞刮刀收集細胞，13 000 r/min離心2 min收集細胞沉淀，用核蛋白提取試劑盒(北京Solarbio公司，0050)按照說明書提取細胞核蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)測量蛋白濃度，定量后用PBS稀釋成相同濃度，加入loading buffer在95 ℃中煮15 min，-20 ℃保存。IκBα、p-IκBα和Cyclin D1蛋白水平的檢測使用細胞總蛋白。以β-actin作為內(nèi)參，其他細胞蛋白提取和Western blot實驗過程同“1.3項”。NF-κB p65(美國CST公司, 8242)、IκBα(武漢三鷹生物公司，10268-1-AP)、p-IκBα(美國Abcam公司,ab133462)和Cyclin D1(武漢三鷹生物公司, 60186-1-Ig)一抗孵育采用1 ∶500的濃度。

2 結果

2.1 PHF5A的mRNA和蛋白在胃正常上皮細胞株及胃癌細胞株中的表達情況PHF5A在胃癌細胞株MKN45、MGC803和AGS中的mRNA水平分別為胃正常上皮細胞株GES-1的1.77倍(t=4.78,P<0.01)、2.16倍(t=8.2,P<0.01)和1.74倍(t=10.53,P<0.01)(圖1A)，其在胃癌細胞株MKN45、MGC803和AGS中的蛋白表達水平分別為GES-1的2.2倍(t=9.045,P<0.01)、2.4倍(t=13.22 ,P<0.01)和1.4倍(t=3.96,P<0.05)(圖1B、C)。可見，與胃正常上皮細胞比較，胃癌細胞中的PHF5A在mRNA和蛋白水平上表達均增高，差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 GES-1細胞和MKN45、MGC803、AGS細胞中PHF5A的mRNA和蛋白表達水平

2.2 慢病毒轉染抑制MGC803細胞中PHF5A蛋白表達慢病毒轉染并經(jīng)過藥物篩選以后，在MGC803細胞中，與sh-NC組比較，sh1組蛋白表達水平下降了約43.3 %(t=11.5,P<0.01),sh2組下降了約36.4 %(t=9.42,P<0.01)(見圖2)，表明以慢病毒為工具，使用不同的shRNA序列干擾PHF5A的表達后，兩組干擾質(zhì)?？梢杂行б种莆赴┘毎鸐GC803中PHF5A的基因表達。

圖2 Western blot 法檢測MGC803細胞中PHF5A的敲低效果

2.3 干擾PHF5A表達抑制胃癌細胞的增殖轉染后進行生長曲線計數(shù)和集落形成實驗。到第5天，sh-NC、sh1、sh2組三組間細胞數(shù)量有差異(F=100.69,P<0.01)(圖3)，2周后集落形成率也明顯下降(F=30.295,P<0.01)(圖4)。說明抑制PHF5A的表達可以抑制胃癌細胞的生長，抑制其集落形成的能力。

圖3 慢病毒轉染質(zhì)粒后各組MGC803細胞增殖情況

2.4 干擾PHF5A表達抑制胃癌細胞的遷移采用劃痕實驗檢測細胞的遷移能力 ，結果顯示(圖5)，與sh-NC組(18.12±0.86)%比較，24 h后sh1組(12.48±0.54)%和sh2組(11.26±0.97)%劃痕愈合率分別降低了31%和38%，三組間差異有統(tǒng)計學意義(F=187.37 ,P<0.01)。由此可見抑制PHF5A可以抑制MGC803細胞的遷移能力。

圖4 集落形成實驗分析敲低PHF5A對MGC803細胞集落形成的影響

圖5 劃痕實驗檢測MGC803細胞遷移能力 ×40

2.5 干擾PHF5A表達對胃癌MGC803細胞中NF-κB p65、p-IκBα、Cyclin D1蛋白表達的影響用Western blot法檢測各組細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達水平的變化，可見與sh-NC組比較，sh1組(t=10.03，P<0.01)和sh2組(t=14.88,P=0.001)細胞核內(nèi)NF-κB p65表達水平均下降。與sh-NC組比較，在細胞總蛋白中，在IκBα表達量無明顯變化的前提下，p-IκBα表達減少，Cyclin D1的表達量也減少(圖6)。

圖6 慢病毒轉染胃癌MGC803后各組NF-κB通路中相關蛋白的表達情況

3 討論

胃癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤。雖然近年來胃癌在診斷、手術治療和靶向治療方面都有新的進展，但由于對其發(fā)病的分子機制了解有限，所以很多患者即使在經(jīng)合理治療后，預后仍然較差。

近期有多篇研究[5-9]顯示PHF5A表達的失調(diào)可能和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系。有研究[5]顯示，較之于正常神經(jīng)干細胞，PHF5A是膠質(zhì)母細胞瘤干細胞擴增所必需的。在乳腺癌中，PHF5A在乳腺癌組織中表達增加，它的上調(diào)可以抑制fas介導的凋亡，且和較差的預后相關[6]。在肺腺癌中，PHF5A促進腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲，促細胞進入G0/G1期，抑制順鉑誘導的細胞凋亡。PHF5A小分子抑制劑pladienolide以劑量依賴的形式抑制H1299和A549細胞的生長[7-8]。在結直腸癌中，PHF5A通過乙酰化促進選擇性剪接介導KDM3A的上調(diào)，調(diào)節(jié)代謝和應激反應，促進結腸直腸癌的發(fā)生[9]。本實驗通過Western blot、熒光定量PCR等方法檢測PHF5A在胃正常上皮細胞和多種胃癌細胞mRNA和蛋白水平上的表達情況，并設計兩種shRNA序列在胃癌細胞MGC803敲低PHF5A，探究PHF5A在胃癌細胞株中的作用，以證明PHF5A在腫瘤細胞中的表達高于胃正常上皮細胞，抑制其蛋白表達可以使胃癌細胞MGC803的增殖、克隆形成和遷移能力減弱。

NF-κB通路在免疫反應和炎癥反應中發(fā)揮的作用已經(jīng)為人們所熟知，越來越多的證據(jù)支持其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演了一定的角色[10-13]。早在2001年就有研究[11]提示NF-κB在胃癌細胞核中的表達水平明顯高于鄰近正常上皮細胞，且通過增加uPA等侵襲相關因子參與了胃癌的發(fā)展。2016年文獻[12]報道了NF-κB p65在胃癌組織中的上調(diào)與不良的預后密切相關。文獻[13]提示PHF5A在肝癌中被證實上調(diào)并與NF-κB通路的激活有著密切的關系，在細胞中敲低PHF5A可以抑制肝癌的遷移和侵襲，同時NF-κB抑制劑也可以抑制PHF5A對肝癌細胞遷移和侵襲的促進作用。本研究通過Western blot法檢測抑制PHF5A蛋白表達的胃細胞系MGC803中核蛋白的NF-κB及總蛋白中IκBα、p-IκBα及NF-κB可能的下游基因Cyclin D1的蛋白表達情況，初步探索了PHF5A對胃癌細胞生物學功能產(chǎn)生的影響可能是通過激活NF-κB通路產(chǎn)生的。

綜上，PHF5A在胃癌細胞中高表達，可能作為一種癌基因通過影響NF-κB通路促進了胃癌細胞的增殖和遷移。但其與胃癌的相關性和期間的具體機制尚需要更多的臨床數(shù)據(jù)及動物實驗的補充和證實。