齊曉靜，陳 斌，趙國平

ABT-737是美國Idun實驗室和Abbott實驗室研發(fā)的一種與Bcl-2同源結構域3(Bcl-2 homology 3，BH3)結構類似的模擬物，抑制B細胞淋巴瘤2基因(B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2)家族抗凋亡蛋白Bcl-xL、Bcl-2和Bcl-w的活性。已有實驗數(shù)據(jù)表明ABT-737是有效的凋亡誘導劑[1]。但是，針對ABT-737的研究主要集中在體外培養(yǎng)的細胞，這具有生理受限的缺點。目前，仍然不清楚ABT-737在活體動物細胞觸發(fā)的凋亡中所涉及的關鍵途徑。秀麗線蟲作為模式動物，是許多人類疾病和藥物研究的有用模式動物。秀麗線蟲生殖腺細胞凋亡是正常卵子發(fā)生期間或在細胞質(zhì)脅迫下發(fā)生在性腺環(huán)路區(qū)域的重要生物學事件，其中的調(diào)控因子從線蟲至人進化保守。根據(jù)先前研究報道，秀麗線蟲的生殖腺細胞對外部刺激因子極為敏感，是一種有價值的研究體內(nèi)凋亡信號通路的生物學模型[2-3]。該實驗利用秀麗線蟲作為多細胞真核活體動物模型，深入研究ABT-737對秀麗線蟲生殖腺細胞凋亡的影響及其作用機制，為今后對ABT-737和秀麗線蟲的研究提供進一步實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料實驗所用線蟲品系均購自美國秀麗線蟲遺傳中心。實驗中涉及到的線蟲品系如下：野生型秀麗線蟲：N2 Bristol。凋亡基因egl-1突變品系：MT1082:egl-1(n487)。DNA損傷檢驗點突變品系：WS2277:hus-1(op241)。p53同源蛋白cep-1突變品系：VC172:cep-1(gk138)?；钚匝踝杂苫?reactive oxygen species,ROS)水平檢測品系：CF1553:muls84[(pAD76)sod-3p::GFP+rol-6(su1006)]。MAPK/JNK通路突變品系：VC8:jnk-1(gk7)、FK171:mek-1(ks54)；sek-1(qd127)。

1.2 主要實驗試劑ABT-737購自美國Med Chem Express公司。吖啶橙(acridine orange，AO)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、瓊脂粉、蛋白胨、膽固醇均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。疊氮化鈉(NaN3)購買自北京索萊寶科技有限公司。氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

NGM固體培養(yǎng)基：取17 g瓊脂粉、2.5 g蛋白胨、3 g氯化鈉溶于975 ml超純水中，121 ℃高壓滅菌，冷卻至60 ℃，在無菌環(huán)境中，加入1 ml經(jīng)過滅菌的1 mol/L氯化鈣、1 mol/L硫酸鎂、5 g/L膽固醇(乙醇為溶劑)以及25 ml的1 mol/L磷酸鉀緩沖液(3.56 g磷酸氫二鉀和10.83 g磷酸二氫鉀溶于100 ml超純水中，高溫滅菌后使用)，混勻后倒入培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固后，上鋪一層經(jīng)37 ℃、200 r/min培養(yǎng)14 h左右的OP50菌液，將NGM板烘干即可使用。

M9緩沖液：取3.0 g磷酸二氫鉀、6.0 g磷酸氫二鈉、5.0 g氯化鈉溶于1 L超純水中，121 ℃高壓滅菌，滅菌后加入1 ml無菌的1 mol/L硫酸鎂，混勻分裝。

1.3 線蟲培養(yǎng)及同步化所有線蟲在20 ℃恒溫避光培養(yǎng)，以尿嘧啶缺陷型大腸桿菌OP50為食物，培養(yǎng)基為NGM固體培養(yǎng)基或M9液體培養(yǎng)基。同步化處理：將處于產(chǎn)卵期的成蟲用M9緩沖液沖洗至離心管中，將M9線蟲緩沖液、次氯酸鈉溶液和5 mol/L的氫氧化鈉溶液以7 ∶2 ∶1的體積比混合均勻，待蟲體裂解后，離心去上清，反復沖洗沉淀后，將所得受精卵均勻分散至3 ml的M9緩沖液中，20 ℃避光培養(yǎng)(≥18 h)即可得到L1期的幼蟲。將上述所得幼蟲接種到平鋪OP50的NGM板上培養(yǎng)，就可得到同步化生長的線蟲。

1.4 ABT-737處理液配置ABT-737用DMSO溶解配制成濃度為50 mmol/L的儲存液，取部分儲存液稀釋成5、10、20 mmol/L的處理液，-20 ℃保存待用。實驗時用M9緩沖液稀釋至實驗所需要的濃度5、10、20 μmol/L。DMSO在總體積中含量為1‰。

1.5 生殖腺細胞凋亡檢測將同步化的秀麗線蟲培養(yǎng)至L4期后，將線蟲在Control組(1‰的DMSO)和實驗組(不同濃度的ABT-737處理)條件下液體培養(yǎng)24 h，從24孔板中收集線蟲，以20 mg/L的吖啶橙20 ℃避光染色1 h。染色結束后，將線蟲轉移至新的含有OP50的NGM板上恢復45 min，使腸道內(nèi)及表皮上的吖啶橙清除干凈。之后，用NaN3麻醉線蟲并通過Leica正置熒光顯微鏡(DM4B)觀察凋亡細胞，凋亡細胞呈致密的亮黃色。

1.6 活性氧水平檢測CF1553線蟲是超氧化物歧化酶3(SOD3)的綠色熒光品系，超氧化物歧化酶(SOD)是線蟲體內(nèi)清除ROS的首要物質(zhì)，線蟲體內(nèi)SOD水平的高低與ROS水平直接相關，SOD3是其中表達變化最明顯的，因此利用熒光品系CF1553線蟲進行ROS水平的檢測[4]。同步化處理后培養(yǎng)至L4期的CF1553線蟲經(jīng)ABT-737處理24 h后，挑取線蟲至載玻片上，并用NaN3麻醉線蟲。使用Leica正置熒光顯微鏡的常規(guī)綠色熒光觀察，在同一設置條件下對線蟲進行圖像攝取，攝取的圖像用軟件ImageJ測量每條線蟲的相對熒光，統(tǒng)計線蟲的平均相對熒光。

2 結果

2.1 ABT-737誘導線蟲生殖腺細胞凋亡將同步化的N2野生型線蟲培養(yǎng)至L4期，暴露于含0、5、10、20 μmol/L的ABT-737液體環(huán)境中24 h后，探究ABT-737對秀麗線蟲生殖腺細胞凋亡的影響。在濃度為10、20 μmol/L的ABT737處理N2線蟲后，野生型線蟲N2的凋亡細胞數(shù)目從(2.31±0.06)個增加至(4.02±0.09)、(4.40±0.08)個，見圖1A。與Control組比較，ABT-737處理線蟲后凋亡細胞數(shù)目增加(P<0.05)，表明ABT-737以劑量依賴的方式誘導秀麗線蟲生殖腺細胞凋亡。

圖1 ABT-737誘導線蟲生殖腺細胞凋亡

2.2 ABT-737通過調(diào)控ROS來誘導生殖腺細胞凋亡本實驗利用SOD3的熒光強度來檢測ROS的產(chǎn)生，探討ROS在ABT-737誘導的生殖腺細胞凋亡中的作用。對熒光品系CF1553線蟲進行20 μmol/L ABT-737藥物處理24 h，將Control組相對熒光強度設為1，與Control組比較，20 μmol/L ABT-737處理線蟲后CF1553線蟲的熒光強度增加，相對熒光強度上升至Control組的(1.30±0.02)倍(P=0.001 6)，即說明ROS水平上升。見圖2。

圖2 ABT-737通過調(diào)控ROS來誘導生殖腺細胞凋亡

2.3 ABT-737通過JNK通路調(diào)控生殖腺細胞凋亡本實驗利用mek-1、jnk-1(JNK通路中的作用因子)這2種缺陷型線蟲品系驗證JNK通路是否參與細胞凋亡。20 μmol/L ABT-737處理24 h后，mek-1和jnk-1這2種缺陷型品系線蟲的凋亡細胞數(shù)未有增加，見圖3。結果表明，JNK通路參與調(diào)控ABT-737誘導的生殖腺細胞凋亡。

2.4 DNA損傷應答途徑參與ABT-737誘導生殖腺細胞凋亡為了檢查DNA損傷應答途徑與ABT-737誘導的細胞凋亡的關系，將L4期的hus-1、cep-1、egl-1缺陷型線蟲品系暴露于20 μmol/L ABT-737中24 h。與Control組比較，20 μmol/L ABT-737處理未能引起這3種線蟲品系的生殖腺細胞凋亡的增加，見圖4。這些數(shù)據(jù)表明，這些DNA損傷應答基因對ABT-737誘導的生殖細胞凋亡是不可缺少的，DNA損傷應答途徑參與ABT-737誘導的生殖細胞凋亡。

圖3 ABT-737通過JNK通路調(diào)控生殖腺細胞凋亡

圖4 DNA損傷應答途徑參與ABT-737誘導生殖腺細胞凋亡

3 討論

ABT-737作為一種BH3結構類似的模擬物，是Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w的一種強有力的抑制劑，ABT-737對許多腫瘤細胞的生存至關重要，能夠誘導體外培養(yǎng)的腫瘤細胞凋亡。但是，越來越多的證據(jù)表明[5-6]，在體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中研究潛在的候選藥物的生物學效應具有生理機制的局限性，比如無法模擬體內(nèi)環(huán)境對藥物生物學效應的影響。為了克服體外細胞培養(yǎng)研究的缺點，且由于秀麗線蟲的基因組與人的基因組有40%～60%的相似性，本研究以秀麗線蟲作為多細胞真核生物模型，探究ABT-737在活體生物上對線蟲內(nèi)源性生殖腺細胞凋亡的影響及其作用機制。

在先前細胞研究中，ABT-737通過與Bcl-2的結合從而降低正常狀態(tài)的Bcl-2/Bax異質(zhì)二聚體, 激活Bax活性，從而改變線粒體膜通透性，激活細胞內(nèi)源性凋亡通路，并且ABT-737還會誘導產(chǎn)生ROS，并激活JNK通路，進而誘導腫瘤細胞凋亡[7-8]。在本研究中，ABT-737與在細胞中的作用相同，可以誘導線蟲生殖腺細胞凋亡，且產(chǎn)生ROS。ROS水平上升觸發(fā)的主要信號傳導途徑是DNA損傷反應途徑[9]。在秀麗線蟲中，hus-1是DNA損傷誘導細胞凋亡所必需的檢查點基因，DNA損傷反應被認為是秀麗線蟲生殖腺細胞中應激誘導的細胞凋亡的重要觸發(fā)因素。作為抑癌蛋白p53的同源物，cep-1對秀麗線蟲中DNA損傷劑誘導的凋亡也至關重要。hus-1將DNA損傷應答信號傳輸?shù)絚ep-1，cep-1隨后通過促進靶基因egl-1的轉錄來促進凋亡信號[10-13]。本研究的結果驗證了這一通路中的3種作用因子在ABT-737誘導的線蟲生殖腺細胞凋亡中起作用。在秀麗線蟲和哺乳動物中JNK通路具有保守性，mek-1和jnk-1這2個基因是 JNK通路中的作用因子，在激活JNK通路中起重要作用。其中mek-1與人MAP2K7基因同源，jnk-1與人MAPK10基因同源，在mek-1和jnk-1缺陷型線蟲中發(fā)現(xiàn)這2種基因參與ABT-737誘導的線蟲生殖腺細胞凋亡。以上這些結果初步說明，ABT-737能使秀麗線蟲產(chǎn)生大量ROS，激活氧化應激反應進而會觸發(fā)JNK/MAPK通路和DNA損傷應答途徑，誘導最終凋亡的發(fā)生。

本研究證實ABT-737在秀麗線蟲活體水平上誘導生殖腺細胞凋亡發(fā)生。研究結果對活體動物內(nèi)源性細胞中ABT-737觸發(fā)的信號傳導途徑有了新的認識，為今后對ABT-737和秀麗線蟲的研究提供了進一步的實驗數(shù)據(jù)。