張佳佳，喻 鑫，周 波，劉 弋

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，晚期胃癌預(yù)后較差。當(dāng)前對(duì)于胃癌主要的治療手段包括外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)藥物治療及靶向治療。由于當(dāng)前針對(duì)胃癌的靶向治療藥物較少，化學(xué)藥物治療仍然是晚期胃癌的重要治療手段。順鉑是胃癌治療的常用化療藥物，但藥物耐受是亟待解決的重要問題[1-3]。該研究旨在檢測(cè)SNAP29基因?qū)ξ赴┘?xì)胞順鉑耐藥性的作用，進(jìn)一步分析SNAP29在胃癌患者中臨床病理學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料本課題收集了安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017～2019年手術(shù)切除的患者石蠟組織標(biāo)本，包括50例胃癌組織標(biāo)本和50例正常胃組織標(biāo)本，同時(shí)收集了胃癌患者的臨床病理學(xué)參數(shù)，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤的分級(jí)和分期。患者對(duì)實(shí)驗(yàn)的開展知情同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中涉及的胃癌細(xì)胞系MKN-45和AGS均來(lái)源ATCC (American Type Culture Collection)，均根據(jù)推薦條件在37 ℃恒溫5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 質(zhì)粒合成和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)選取哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pIRESneo3 (Invitrogen)來(lái)構(gòu)建SNAP29的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。SNAP29的編碼序列(GenBank識(shí)別碼： NM_004782.4)克隆進(jìn)pIRESneo3質(zhì)粒，被命名為pIRESneo3-SNAP29。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用lip2000 (QIAGEN)轉(zhuǎn)染試劑，按照說(shuō)明書推薦的條件進(jìn)行，參考文獻(xiàn)操作[4]。

1.4 Western blotWestern blot參考文獻(xiàn)操作[4]。對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行收集，使用細(xì)胞裂解液(Cell Signaling)裂解細(xì)胞并提取蛋白。提取的蛋白使用BCA Protein Assay kit (Pierce)試劑測(cè)定濃度。Western blot實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、酶標(biāo)二抗孵育、顯影過(guò)程。實(shí)驗(yàn)中主要的抗體包括兔SNAP29多克隆抗體(1 ∶1 000, 12704-1-AP)和鼠β-actin單克隆抗體(1 ∶10 000, 66009-1-Ig)(美國(guó)芝加哥Proteintech集團(tuán)有限公司)。β-Actin作為內(nèi)參。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)操作[4]。具體過(guò)程如下：已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞24 h后消化打散成單細(xì)胞計(jì)數(shù)，種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔種植細(xì)胞5 000個(gè)，同組細(xì)胞種植3孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后相應(yīng)加入0、3、6 mg/L順鉑處理，48 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，測(cè)定570 nm的吸光度。

1.6 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞克隆形成。具體過(guò)程是在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪設(shè)含0.5%瓊脂糖的1640培養(yǎng)基(1.5 ml)，凝固成下層膠，已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞24 h后消化打散成單細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取相應(yīng)數(shù)目的細(xì)胞加入含0.35%瓊脂糖的1640培養(yǎng)基，種植于6孔板下層膠上，每孔對(duì)應(yīng)5 000個(gè)細(xì)胞，1.5 ml培養(yǎng)基，室溫凝固后，上層加入2 ml的1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗)。細(xì)胞種植48 h后相應(yīng)加入0、6 mg/L順鉑處理48 h，細(xì)胞再培養(yǎng)4 d后檢測(cè)克隆形成。每組重復(fù)3孔，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)操作[4]。具體過(guò)程包括石蠟組織切片的脫蠟、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷、抗體孵育、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、切片脫水封片等過(guò)程。實(shí)驗(yàn)使用邁新生物公司的Envision法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒和兔SNAP29多克隆抗體(1 ∶200, 12704-1-AP，美國(guó)芝加哥Proteintech集團(tuán)有限公司)。SNAP29為胞質(zhì)表達(dá)，在組織中細(xì)胞表達(dá)比例≥15%被定義為SNAP29陽(yáng)性，<15%被定義為SNAP29陰性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。本課題實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。MTT實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。SNAP29表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析使用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在胃癌細(xì)胞MKN-45中過(guò)表達(dá)SNAP29檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性在本研究中構(gòu)建了SNAP29過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pIRESneo3-SNAP29，轉(zhuǎn)染MKN-45胃癌細(xì)胞系，記為MKN-45 SNAP29；對(duì)照pIRESneo3空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MKN-45細(xì)胞系被記為MKN-45 Vec。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示MKN-45 SNAP29細(xì)胞中SNAP29蛋白表達(dá)水平高于MKN-45 Vec細(xì)胞(圖1A)。MTT實(shí)驗(yàn)表明，MKN-45 SNAP29和MKN-45 Vec細(xì)胞在不加順鉑情況下的細(xì)胞活力沒有顯著差異，順鉑可以抑制MKN-45 SNAP29和MKN-45 Vec細(xì)胞的細(xì)胞活力；在加入3和6 mg/L順鉑情況下，MKN-45 SNAP29細(xì)胞的細(xì)胞活力高于MKN-45 Vec細(xì)胞(P<0.05)(圖1B)。進(jìn)一步細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示MKN-45 SNAP29和MKN-45 Vec細(xì)胞的克隆形成率無(wú)顯著差異，順鉑抑制MKN-45 SNAP29和MKN-45 Vec細(xì)胞的克隆形成，但是在6 mg/L順鉑處理后，MKN-45 SNAP29細(xì)胞的克隆形成率高于MKN-45 Vec細(xì)胞(P=0.008 3)(圖1C、D)。

圖1 在胃癌細(xì)胞MKN-45中過(guò)表達(dá)SNAP29檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

2.2 在胃癌細(xì)胞AGS中過(guò)表達(dá)SNAP29檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染SNAP29過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照空質(zhì)粒，分別記為AGS SNAP29和AGS Vec。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示AGS SNAP29細(xì)胞中SNAP29蛋白表達(dá)水平高于AGS Vec細(xì)胞(圖2A)。與MKN-45細(xì)胞系相似，AGS SNAP29和AGS Vec細(xì)胞在不加順鉑情況下的MTT細(xì)胞活力無(wú)顯著差異，在加入3和6 mg/L順鉑后，AGS SNAP29和AGS Vec細(xì)胞的細(xì)胞活力均下降，但AGS SNAP29細(xì)胞的細(xì)胞活力高于AGS Vec細(xì)胞(P<0.05)(圖2B)。細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，在6 mg/L順鉑處理情況下，SNAP29過(guò)表達(dá)的AGS細(xì)胞軟瓊脂克隆形成率高于對(duì)照細(xì)胞(P=0.012 7)(圖2C、D)。

圖2 在胃癌細(xì)胞AGS中過(guò)表達(dá)SNAP29檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

2.3 胃癌組織SNAP29的表達(dá)及其臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析本課題組通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了50例胃癌組織標(biāo)本和50例正常胃組織標(biāo)本中SNAP29的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在胃癌組織中SNAP29的陽(yáng)性表達(dá)率是66.0%，在正常胃組織中SNAP29的陽(yáng)性表達(dá)率是62.0%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1、圖3)。同時(shí)，本課題組收集了50例胃癌組織標(biāo)本對(duì)應(yīng)的患者臨床病理學(xué)參數(shù)(包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤的分級(jí)和分期)，進(jìn)一步對(duì)SNAP29表達(dá)情況與這些病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析(表2)。在胃癌患者中，SNAP29陽(yáng)性表達(dá)與胃癌患者的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.042)和腫瘤分期(P=0.023)具有相關(guān)性，而與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分級(jí)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

表1 SNAP29在胃癌和正常組織中的表達(dá)

圖3 SNAP29在胃癌組織和正常組織中的表達(dá) ×200A：胃癌組織；B：正常組織

表2 SNAP29表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析 [ n(%)]

3 討論

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，早期胃癌預(yù)后相對(duì)較好，晚期胃癌治療手段有限，預(yù)后較差。外科手術(shù)、輔助化療或放療是當(dāng)前胃癌治療的主要方式。針對(duì)胃癌常用靶向藥物當(dāng)前僅有曲妥珠單抗，它對(duì)HER2基因擴(kuò)增的胃癌患者療效較好，但HER2基因擴(kuò)增在胃癌中的比例僅僅10%～15%[2-3,5]。順鉑是胃癌常用化療藥物之一，對(duì)晚期胃癌的治療具有一定效果，但是長(zhǎng)期用藥后患者往往產(chǎn)生獲得性藥物耐受。針對(duì)胃癌的順鉑耐藥，許多分子機(jī)制參與其中：Zhu et al[6]報(bào)道了miR-187靶向調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路參與調(diào)控胃癌細(xì)胞順鉑耐藥；SLFN11的甲基化作用促進(jìn)胃癌細(xì)胞的順鉑耐藥性[7]；METase/lncRNA HULC/FoxM1信號(hào)通路通過(guò)抑制細(xì)胞自噬從而降低胃癌順鉑耐藥性[8]。關(guān)于胃癌順鉑耐藥的相關(guān)研究不勝枚舉，其相關(guān)機(jī)制復(fù)雜多樣，更進(jìn)一步的研究迫切而必要。本研究首次報(bào)道SNAP29參與促進(jìn)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥，同時(shí)進(jìn)一步揭示了SNAP29在胃癌患者中的病理學(xué)意義。

SNAP29屬于突觸體相關(guān)蛋白(SNAP)家族成員，參與SNARE(可溶性NSF附著受體)蛋白(SNARES)生物學(xué)功能。SNAP家族包括SNAP25、SNAP23和SNAP29，前兩種蛋白分別是膜相關(guān)蛋白，控制突觸傳遞，參與廣泛的非神經(jīng)元膜融合過(guò)程；SNAP29僅短暫的與膜結(jié)合，它包含一個(gè)酸性NPF基序，介導(dǎo)與內(nèi)吞因子的結(jié)合[9]。許多研究[9-13]表明SNAP29在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、自噬和突觸傳遞等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。Mastrodonato et al[10]預(yù)測(cè)SNAP29可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及神經(jīng)退行性變中發(fā)揮重要作用。但目前為止，關(guān)于SNAP29在人體腫瘤中研究的報(bào)道十分有限，關(guān)于SNAP29在人體胃癌中的功能仍然是未知的。本課題在胃癌細(xì)胞MKN-45和AGS中轉(zhuǎn)染SNAP29過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)研究SNAP29對(duì)細(xì)胞功能的作用。從圖1和圖2的結(jié)果來(lái)看，SNAP29的過(guò)表達(dá)對(duì)MKN-45和AGS細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞克隆形成能力均無(wú)顯著作用，因此可以推斷SNAP29對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖能力并沒有顯著影響。

本課題在兩種胃癌細(xì)胞系MKN-45和AGS中，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)兩種實(shí)驗(yàn)方法證明了SNAP29的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。但限于實(shí)驗(yàn)條件限制，本課題沒有揭示出SNAP29促進(jìn)胃癌順鉑耐藥的下游分子機(jī)制，這是下一步工作應(yīng)該致力的方向。根據(jù)先前報(bào)道，SNAP29參與調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程，SNAP29參與形成自噬體上的Syx17-Snap29復(fù)合物，是啟動(dòng)復(fù)合體與溶酶體上的Vamp8融合的關(guān)鍵[9,13-14]。因此在胃癌細(xì)胞中SNAP29很可能參與促進(jìn)細(xì)胞自噬，從而介導(dǎo)了促進(jìn)順鉑耐藥的功能。Zhou et al[15]發(fā)現(xiàn)OGT的下調(diào)可以抑制SNAP29的O-GlcNAc修飾作用，從而促進(jìn)了SNAP29-Stx17-VAMP8復(fù)合物的形成和細(xì)胞自噬過(guò)程，該機(jī)制促進(jìn)了卵巢癌對(duì)于順鉑的耐藥性。因此SNAP29在胃癌中促進(jìn)順鉑耐藥很可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬介導(dǎo)的，該具體機(jī)制在后續(xù)工作中將繼續(xù)研究。

本課題檢測(cè)了SNAP29在胃癌組織和正常胃組織中的蛋白水平，二者無(wú)顯著差異。SNAP29在正常胃組織中的陽(yáng)性率高達(dá)62.0%，這表明SNAP29在正常組織中也是發(fā)揮重要功能的。據(jù)報(bào)道[9-13]SNAP29參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)動(dòng)、有絲分裂、自噬和突觸傳遞等過(guò)程，因此在胃組織中SNAP29很可能也參與了細(xì)胞的相關(guān)生理過(guò)程，但其具體作用仍是未知的，也是后續(xù)工作需要進(jìn)一步研究的方向。胃癌患者病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SNAP29與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤分級(jí)無(wú)相關(guān)性，該結(jié)果證明了SNAP29在胃癌患者中的表達(dá)沒有年齡和性別傾向，與腫瘤的增殖和生長(zhǎng)非顯著相關(guān)；SNAP29與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期具有相關(guān)性，該結(jié)果證明SNAP29可能對(duì)胃癌的轉(zhuǎn)移具有一定促進(jìn)功能?？傮w而言，SNAP29的高表達(dá)與胃癌患者的不良病理特征密切相關(guān)，在臨床上具有一定意義。

總之，本課題首次報(bào)道了SNAP29在人體胃癌中的功能，明確了SNAP29在胃癌患者中的病理學(xué)意義。該研究對(duì)于進(jìn)一步了解SNAP29的生理學(xué)功能，胃癌順鉑耐藥機(jī)制具有一定意義，也為胃癌研究和治療提供了新的靶標(biāo)。