王 宇，范璐璐

肝癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)[1]，全世界新發(fā)肝癌患者每年約 70 萬(wàn)，居惡性腫瘤的第 5 位，肝癌因此被稱為“腫瘤之王”。索拉非尼是治療晚期肝癌的重要一線靶向藥物，但其治療效果尚不滿意[2]，因此努力尋找有效的藥物和最優(yōu)化的治療方法是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(bromodomain-containing protein 4, BRD4)屬于溴化結(jié)構(gòu)和BET家族蛋白，BRD4通過(guò)結(jié)合組蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞的靶基因活化或抑制, 還可以結(jié)合乙酰化的非組蛋白, 來(lái)調(diào)控DNA復(fù)制、細(xì)胞周期及基因轉(zhuǎn)錄等其他細(xì)胞活動(dòng)。因此，BRD4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[3]。JQ1是一種小分子化合物, 是BET家族蛋白抑制劑, 可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于BRD4溴化結(jié)構(gòu), 阻止BRD4與乙酰化的賴氨酸結(jié)合[4]。該研究通過(guò)觀察JQ1聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞株的增殖抑制作用，并探討其可能的機(jī)制，為肝癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細(xì)胞株HepG2、Bel-7402購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；索拉非尼購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；JQ1購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；兔來(lái)源抗人Bcl-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔來(lái)源抗人c-MYC單克隆抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；兔來(lái)源抗人BIM單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；鼠來(lái)源抗人Actin抗體和所有二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司；胰蛋白酶和DMSO均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)所有細(xì)胞在含有10%胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)，1～2 d換液一次，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。首先，將HepG2和Bel-7402以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。用JQ1(1 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯(lián)合索拉非尼分別處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，24、48 h之后向每個(gè)孔中加入10 μl MTT試劑，在37 ℃下孵育4 h。 然后，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并向每個(gè)孔中加入150 μl DMSO。 在37 ℃條件下孵育15 min。 最后，通過(guò)酶標(biāo)儀在490 nm處確定每個(gè)孔的吸光度值。根據(jù)測(cè)量的吸光度值計(jì)算每個(gè)孔的增殖抑制率。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按2×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。貼壁后加入DMSO、JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯(lián)合索拉非尼分別處理細(xì)胞，24、48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，獲取上清后使用預(yù)冷的PBS洗滌后離心，將離心后的細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中, 加入5 μl Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min，之后加入5 μl PI混勻。室溫避光孵育5 min。使用FACS流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞。早期和晚期凋亡細(xì)胞均包括在細(xì)胞死亡測(cè)定中。

1.5 蛋白提取與Western blot實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后按2×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。貼壁后加入JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯(lián)合索拉非尼分別處理細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，24 h后加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液置于冰上裂解30 min，將裂解物在低溫(4 ℃)和高速(15 000 r/min)下離心15 min。通過(guò)BCA試劑盒檢測(cè)上清液的蛋白質(zhì)含量。在純化的蛋白質(zhì)樣品中加入蛋白上樣緩沖液，并在95 ℃條件下加熱10 min。通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，并在恒定電流下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用5 %脫脂牛奶封閉含有蛋白質(zhì)的膜，在4 ℃下與特異性一抗孵育過(guò)夜，然后加入相應(yīng)的二抗(1 ∶50 000)在37 ℃孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光顯影液使蛋白質(zhì)條帶可視化，上機(jī)掃描捕獲信號(hào)并保存。

2 結(jié)果

2.1 JQ1聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用使用MTT測(cè)定法分別檢測(cè)對(duì)照組、JQ1(1 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯(lián)合索拉非尼作用于HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞24 h或48 h后，肝癌細(xì)胞的增殖抑制率(圖1)。結(jié)果顯示，在HepG2肝癌細(xì)胞中，24 h各組的增殖抑制率分別是(14.31±0.79)%、(23.94±1.23)%、(32.36±1.72)%和(61.78±1.48)%；48 h各組的增殖抑制率分別是(8.47±1.73)%、(46.32±6.45)%、(54.40±1.30)%和(65.86±2.76)%。在Bel-7402肝癌細(xì)胞中，24 h各組的增殖抑制率分別是(7.43±1.65)%、(34.82±3.23)%、(44.87±7.34)%和(58.50±0.40)%；48 h各組的增殖抑制率分別是(8.77±1.90)%、(33.87±036)%、(42.61±9.50)%和(56.75±0.55)%。單獨(dú)應(yīng)用索拉非尼或 JQ1以及JQ1聯(lián)合索拉非尼組均可在體外抑制肝癌細(xì)胞的增殖，與單藥組比較，聯(lián)合用藥組的增殖抑制率提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FHepG2,24 h=243.177，F(xiàn)HepG2,48 h=30.012，F(xiàn)Bel-7402,24 h=7.62，F(xiàn)Bel-7402,48 h=12.437，均P<0.05)。

圖1 JQ1聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞增殖率的影響

2.2 JQ1聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞的凋亡作用使用Annexin V-FITC / PI流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定對(duì)照組、JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯(lián)合索拉非尼作用于HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞24 h或48 h后的細(xì)胞凋亡率(圖2)。結(jié)果顯示，在HepG2肝癌細(xì)胞中，24 h各組凋亡率分別是(6.53±1.60)%、(9.03±1.44)%、(18.97±2.74)%和(34.00±4.14)%；48 h各組凋亡率分別是(4.57±0.85)%、(12.20±1.78)%、(27.96±7.59)%和(59.73±2.12)%。在Bel-7402肝癌細(xì)胞中，24 h各組凋亡率分別是(7.23±1.53)%、(10.83±1.70)%、(16.20±1.75)%和(26.30±1.43)%；48 h各組凋亡率分別是(7.87±0.63)%、(9.57±0.39)%、(16.60±4.65)%和(48.83±3.77)%。結(jié)果顯示JQ1聯(lián)合索拉非尼處理后，HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FHepG2,24 h=11.016，F(xiàn)HepG2,48 h=18.125，F(xiàn)Bel-7402,24 h=8.174，F(xiàn)Bel-7402,48 h=51.243，均P<0.05)。

圖2 JQ1聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

2.3 JQ1聯(lián)合索拉非尼對(duì)c-MYC、Bcl-2、BIM表達(dá)的影響通過(guò)Western blot檢測(cè)JQ1聯(lián)合索拉非尼對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞中c-MYC和凋亡蛋白Bcl-2，BIM的表達(dá)的影響，在索拉非尼和JQ1單獨(dú)用藥組，Bcl-2和c-MYC表達(dá)降低，BIM表達(dá)增加，以聯(lián)合用藥組最為明顯(圖3)。

圖3 JQ1聯(lián)合索拉非尼對(duì)c-MYC、Bcl-2、BIM表達(dá)的影響

3 討論

索拉非尼是一種口服多激酶抑制劑，是治療晚期肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要靶向藥物。但其療效尚不滿意[5]，因此，發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)手段以期提高肝癌細(xì)胞對(duì)靶向藥物的敏感性，是一種治療腫瘤的新策略。

研究[9]表明在Bcl-2家族的多種成員中，Bcl-2是最主要的凋亡抑制基因，BIM是Bcl-2家族蛋白中最重要的成員，在Bcl-2家族蛋白的4個(gè)結(jié)構(gòu)域(BH1～BH4)中，BIM與BH3具有相同的結(jié)構(gòu)域，在本質(zhì)上具有高度促凋亡作用。BIM在生理和病理生理?xiàng)l件下都啟動(dòng)了內(nèi)在的凋亡通路。BIM表達(dá)的減少與腫瘤的促進(jìn)和自身免疫有關(guān)，而過(guò)表達(dá)則抑制腫瘤生長(zhǎng)和耐藥性，因?yàn)榘┘?xì)胞會(huì)抑制BIM的表達(dá)和穩(wěn)定性[10]。c-MYC基因通過(guò)易位、擴(kuò)增和突變參與許多腫瘤癌變過(guò)程，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等[11]。本研究Western blot結(jié)果顯示，各給藥組均可促進(jìn)了BIM的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，致使HCC細(xì)胞的凋亡。以聯(lián)合用藥組最為顯著，JQ1和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用可能存在協(xié)同作用。

綜上所述，一定濃度JQ1能增強(qiáng)索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制及凋亡作用，其機(jī)制可能在于通過(guò)下調(diào)Bcl-2和c-MYC的表達(dá)，上調(diào)BIM表達(dá)，JQ1和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用可能存在協(xié)同作用，為肝癌的治療提供新思路。但是本研究只是在細(xì)胞水平的初步探討, 還需要大量的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證明。