劉曉慶，魯桓兵，劉瑞雪，宋育林

對乙酰氨基酚 (acetaminophen,APAP)是目前普遍使用的解熱鎮(zhèn)痛劑，過量使用則可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝功能損害甚至急性肝衰竭乃至死亡，是藥物性肝損傷及肝衰竭的常見原因。APAP所致肝損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種機(jī)制，可能與活性代謝產(chǎn)物的形成、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、無菌性炎癥等有關(guān)[1]，確切機(jī)制目前仍不明確。核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)是肝臟中研究較多的炎性小體，其活化后可引起白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-18等炎性因子的釋放，參與APAP誘導(dǎo)的肝損傷[2]。Bruton酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)是胞漿非受體酪氨酸蛋白Tec家族成員之一，對B淋巴細(xì)胞的增殖、分化和凋亡起著重要的調(diào)控作用[3]。近期有文獻(xiàn)報道[4]Btk是先天免疫炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，可通過調(diào)控核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB) 引起NLRP3的激活，也可直接調(diào)控NLRP3的激活。已有研究[5]表明Btk參與缺血再灌注性肝損傷，抑制Btk可減輕肝臟的炎性損傷，然而其在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中的作用及機(jī)制目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，該研究重點研究APAP誘導(dǎo)的肝損傷中Btk、磷酸化Btk(phosphorylated Btk，p-Btk)、NF-κB、NLRP3、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 的動態(tài)變化，從而探討B(tài)tk在APAP肝損傷中的重要作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物54只SPF級健康成年的C57BL/6J雄性小鼠，鼠齡6～8周，體質(zhì)量18～24 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0002。

1.2 實驗材料與儀器APAP(純度大于99%)購自美國MedChemExpress公司；小鼠TNF-α、IL-1β elisa試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司；Btk抗體[Btk(D3H5)Rabbit mAb×8547]、p-Btk抗體均購自美國Cell Signaling公司；NLRP3抗體購自英國Abcam公司；NF-κB抗體購自英國Abcam公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE (5×) 蛋白上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；全自動生化分析儀購自瑞士RocheModular 公司；紫外分光光度計購自上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；成像系統(tǒng)購自美國阿爾法公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1實驗分組與方法 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，54只小鼠隨機(jī)分為9組，每周6只，分別為對照組(APAP 0 h組)、APAP 0.5 h組、APAP 1 h組、APAP 3 h組、APAP 6 h組、APAP 12 h組、APAP 24 h組、APAP 36 h組、APAP 48 h組，所有小鼠禁食不禁水12 h后，APAP 0.5 h組、APAP 1 h組、APAP 3 h組、APAP 6 h組、APAP 12 h組、APAP 24 h組、APAP 36 h組、APAP 48 h組小鼠分別單劑量腹腔注射APAP 300 mg/kg，對照組小鼠腹腔注射0.9%生理鹽水同等體質(zhì)量APAP組小鼠。所有小鼠自由進(jìn)食水，明暗各12 h，溫度20～25 ℃，相對濕度(50±5)%。所有小鼠均自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。分別在相應(yīng)的時間小鼠處死前稱量小鼠體質(zhì)量，用10%的水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后摘除小鼠眼球收集血液，斷頭處死。全血標(biāo)本于4 ℃冰箱靜置過夜后，3 500 r/min離心15 min留取上清液，-20 ℃凍存待測。剪取部分肝左葉用10%福爾馬林緩沖液固定行肝臟病理學(xué)檢查，其余肝臟組織凍存于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃ 冰箱儲存待測。

1.3.2血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性檢測 全自動化生化分析儀檢測ALT、AST活性。

1.3.3肝組織病理學(xué)觀察 經(jīng)10%福爾馬林緩沖液固定的肝臟標(biāo)本，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(厚5 μm)，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)改變。采用Image-Pro Plus 6.0高清晰圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。計算肝臟壞死面積百分比=(陽性細(xì)胞所占面積/整個視野總面積)×100%。

1.3.4ELISA檢測肝勻漿IL-1β和TNF-α的表達(dá) 剪取-80 ℃凍存的肝組織按1 ∶9(g ∶ml)加入相應(yīng)的PBS勻漿肝組織，留取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟測定IL-1β、TNF-α。

1.3.5Western blot檢測肝臟Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá) 剪取適量的肝組織加入RIPA裂解液充分勻漿提取總蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白定量。加入SDS-PAGE (5×) 蛋白上樣緩沖液，沸水中煮沸 5 min，-80 ℃ 冰箱中凍存。以β-actin(1 ∶1 000)作為內(nèi)參，以抗Btk抗體(1 ∶3 000)、抗p-Btk抗體(1 ∶1 000)、抗NF-κB抗體(1 ∶5 000)、抗NLRP3抗體(1 ∶2 500)和抗β-actin抗體(1 ∶1 000)作為一抗進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍攝分析。

2 結(jié)果

2.1 ALT和AST酶活性檢測結(jié)果與對照組比較，APAP腹腔注射0.5、1 h組小鼠血清ALT、AST水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；給藥后3 h血清ALT、AST升高，持續(xù)至24 h仍維持在較高水平(P<0.01)，36、48 h血清ALT、AST下降，但仍高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 不同時間點血清ALT、AST變化

2.2 肝組織病理檢查結(jié)果對照組，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見肝細(xì)胞變性、壞死以及肝竇充血。APAP處理后0.5、1 h肝臟病理形態(tài)學(xué)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。APAP處理后3 h肝竇充血,可見點狀壞死灶，APAP處理后6、12 h肝竇充血明顯，壞死面積逐漸增大，持續(xù)至24 h，主要表現(xiàn)為小葉中心性壞死；APAP處理36 h后肝臟病理變化逐漸減輕，壞死面積逐漸減少。APAP干預(yù)后的各組小鼠肝臟壞死程度較對照組有變化(F=29.845，P=0.000)。見圖1、2。

2.3 肝組織勻漿IL-1β、TNF-α檢測結(jié)果與對照組比較，APAP腹腔注射1、3 h后，TNF-α、IL-1β分別開始升高，且均在24 h時含量最高(P<0.01)，后逐漸降低。見表2。

2.4 Western blot 檢測結(jié)果與對照組比較，APAP干預(yù)后的各組小鼠肝臟Btk(F=441.280，P=0.000)、p-Btk(F=1 323.022，P=0.000)、NF-κB(F=133.125，P=0.000)及NLRP3水平(F=820.095，P=0.000)含量均有變化。正常肝組織中僅有少量的Btk表達(dá)，APAP處理組小鼠隨著給藥時間的延長，Btk及p-Btk的表達(dá)逐漸增多，于24 h表達(dá)最高(P<0.01)，后表達(dá)逐漸下降。NF-κB、NLRP3表達(dá)與Btk及p-Btk表達(dá)變化趨勢相一致。見圖3。

圖1 不同時間點肝臟病理學(xué)變化 × 200

表2 不同時間點肝組織IL-1β、TNF-α表達(dá)量

圖2 不同時間點小鼠肝臟壞死面積

3 討論

APAP引起的肝損傷病理組織學(xué)主要表現(xiàn)為肝小葉中心性壞死[6-7]。ALT、AST是目前評價肝臟損傷程度的常用指標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示，小鼠單次腹腔注射APAP(300 mg/kg)0.5、1 h，血清ALT、AST及肝臟病理形態(tài)學(xué)與對照組無明顯差異；其余各組血清中ALT、AST水平、3 h后各組肝細(xì)胞壞死面積明顯高于對照組，同時肝臟HE染色也可見不同程度的肝竇充血。這些生化及病理改變與相關(guān)文獻(xiàn)報道[6-7]一致，提示APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型復(fù)制成功。本實驗研究發(fā)現(xiàn)APAP(300 mg/kg)單次干預(yù)造成的肝損傷并非完全隨時間的延長而加重，36 h后肝損傷的程度有所減輕，提示單次APAP造成的小鼠肝損傷存在自身修復(fù)過程。

圖3 各組小鼠肝組織Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)情況

APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死的發(fā)生與過量服用APAP或肝臟基礎(chǔ)水平還原型谷胱甘肽被耗竭，代謝產(chǎn)生的N-乙酰對苯醌亞胺不能被肝臟還原型谷胱甘肽結(jié)合，造成肝細(xì)胞代謝損傷和氧化應(yīng)激損傷，破壞線粒體膜等有關(guān)[1]。Btk是一種非受體型酪氨酸激酶，表達(dá)于除T淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞的髓系細(xì)胞。Btk通過調(diào)控中性粒細(xì)胞募集和激活參與炎癥過程[5]。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)菌、真菌、病毒及其他危險信號的刺激時，Btk以磷酸化的形式活化后可直接調(diào)節(jié)NLRP3或間接調(diào)節(jié)NLRP3等信號進(jìn)而引起炎性因子的釋放[3-4]。Btk參與調(diào)控多個重要炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中許多關(guān)鍵的信號蛋白，包括NF-κB、NFAT、PKC、Pin1、TLRs、caveolin-1 等[8]。近期研究[5]表明在小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型中，Btk抑制劑可減輕缺血再灌注引起的肝臟炎性損傷。本實驗結(jié)果顯示：正常小鼠肝組織中僅有少量Btk表達(dá)；APAP作用24 h內(nèi)，隨著APAP作用時間的延長，小鼠肝組織中Btk及p-Btk逐漸升高，肝損傷的嚴(yán)重程度與Btk及p-Btk表達(dá)變化趨勢相一致。提示Btk的活化參與了APAP肝損傷病理的形成。

Btk是先天免疫炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，參與調(diào)控炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中許多關(guān)鍵的信號蛋白[4,8]，其參與APAP誘導(dǎo)的肝損傷可能作用機(jī)制為：① 激活NF-κB導(dǎo)致NLRP3形成及炎性因子升高。文獻(xiàn)報道Btk/NF-κB信號通路可參與視神經(jīng)脊髓炎的發(fā)病，引起急性炎癥[9]。NF-κB可激活NLRP3炎性體造成炎性因子過度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥和自身免疫疾病的進(jìn)展[10-11]。抑制Btk、NF-κB信號通路可顯著控制炎癥及減輕疾病[12-13]。通過藥物或遺傳手段抑制Btk可嚴(yán)重抑制NLRP3炎性小體的激活，減輕IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放，進(jìn)而減輕缺血性腦損傷引起的炎性反應(yīng)[14]。本實驗結(jié)果顯示，正常小鼠肝組織中僅有少量Btk表達(dá)，隨著APAP作用時間的延長，小鼠肝組織中Btk及p-Btk逐漸升高，NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表達(dá)也逐漸升高，肝損傷的嚴(yán)重程度與Btk及p-Btk、NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表達(dá)變化趨勢相一致。表明Btk磷酸化可能激活了NF-κB導(dǎo)致NLRP3形成及炎癥因子升高引起了肝損傷。② 直接激活NLRP3炎性小體。NLRP3炎癥小體的激活一方面主要通過激活NF-κB通路上調(diào)NLRP3和 pro-IL-1β的蛋白表達(dá)，另一方面線粒體DNA,穿孔毒素，病原體相關(guān)成分等信號也參與其激活[15]。近年來有文獻(xiàn)[14]報道Btk是NLRP3炎性小體的重要組成部分，在炎癥小體中起重要作用，可通過物理方式直接與NLRP3、ASC相互作用，激活炎性反應(yīng)，引起炎性損傷。但APAP導(dǎo)致的急性肝損傷中，Btk激活NLRP3的確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Btk在單次APAP致肝損傷的過程中存在動態(tài)變化，APAP誘導(dǎo)的肝損傷中Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表達(dá)變化與肝損傷的嚴(yán)重程度基本相一致，表明Btk可能在APAP肝損傷中起著重要作用，將為尋找APAP肝損傷新的防治靶點提供了理論基礎(chǔ)。