胡景春，唐 虹，薛 威，江 勤，張駿艷，董六一

心血管疾病已成為近年來人類死亡的最主要殺手之一，研究心血管疾病的發(fā)病機制與藥物開發(fā)已成為當前熱點課題。在心血管疾病中，心肌缺血再灌注損傷因其具有高發(fā)病率、高致死率等而嚴重影響心血管疾病患者的健康。已有文獻報道[1-2]，心肌缺血再灌注損傷機制復雜、牽涉途徑廣，如氧化應激、自噬、凋亡以及能量代謝障礙等。牡荊素是從山楂葉中提取分離的有效單體成分[3]，課題組前期研究表明牡荊素具有抗氧化、抑制凋亡和保護心腦缺血等作用[4-5]，但其抗缺血再灌注損傷的機制仍不明確。該研究旨在前期研究的基礎上通過制備大鼠原代心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenntion，H/R)模型，探討牡荊素是否通過抑制自噬和自噬流途徑介導原代心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用，并初步分析牡荊素潛在的抗心肌細胞缺氧復氧損傷的作用機制，為臨床應用提供新思路和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠乳鼠(出生24 h)共30只，購自安徽醫(yī)科大學省級實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(皖)2017-001。

1.2 藥品與試劑牡荊素(凍干粉針劑，30 mg/瓶，批號20171215，純度99.5%，購自合肥七星醫(yī)藥科技有限公司，常溫保存，臨用前稀釋成所需濃度)；DMEM/F12購自美國Gibco公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；Cellmax胎牛血清購自北京賽澳美細胞技術有限公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；細胞裂解液購自江蘇碧云天生物技術公司；吐溫-20購自美國Sigma公司；青-鏈霉素(雙抗)購自江蘇碧云天生物技術公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)購自北京中杉金橋有限公司；LDH試劑盒、CCK-8試劑盒和DCFH-DA試劑盒購自凱基生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購自江蘇碧云天生物技術公司；PMSF購自美國Sigma公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；預染蛋白Marker購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；LC3B抗體、Beclin1抗體、P62抗體購自英國Abcam公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；自噬雙標腺病毒購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.3 主要儀器HH-4數(shù)據(jù)恒溫水浴鍋購自江蘇常州國華電器有限公司；BX-51型熒光正置顯微鏡購自日本Olympus Corporation 公司；NW10UF超純水機購自上?？道追治鰞x器有限公司；TGL-16R高速冷凍離心機購自珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；SpectraMax190全波長酶標儀購自美國Molecular Devices 公司；制冰機購自常熟雪科電器有限公司；電泳儀和轉移槽購自美國BIO-RAD 公司；JA1203A電子天平購自上海精天電子儀器有限公司；WD-9405B水平搖床購自北京市六一儀器廠； Bioshine ChemiQ4600熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海歐翔科學儀器公司。

1.4 實驗方法

1.4.1大鼠原代心肌細胞培養(yǎng) 取24 h內新出生的SD乳鼠10只，先將乳鼠頸部剪一道小口排出血液(防干擾后續(xù)操作)；將乳鼠浸于75%的乙醇中約75 s后取出，于超凈臺中迅速取出乳鼠心臟置于裝有D-Hank液的培養(yǎng)皿中，此操作在冰浴上進行；將剪下的乳鼠心臟在D-Hank液中清洗2～3次并剪去多余的組織，然后將其轉移至青霉素瓶中剪碎，大小約為1 mm×1 mm×1 mm；加入適量的D-Hank液洗去殘留的血液，靜置棄去上清液；加入適量的混合酶，將組織塊轉移至15 ml的離心管中，置于37 ℃的水浴鍋中水浴消化15 min；待消化結束后取出離心管，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基吹打混勻，靜置，將上清液轉移至干凈的離心管中；加入適量的D-Hank液吹打混勻后靜置棄去上清液；重復上述操作步驟兩次；將3次消化后得到的上清液用200目的細胞篩過濾，將過濾后的上清液置于培養(yǎng)皿中于5% CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)1.5 h；待培養(yǎng)結束后，取出培養(yǎng)皿，將上清液轉移至培養(yǎng)瓶中，加入終濃度為0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyUridine，Brdu)溶液抑制成纖維細胞的生長，再置于 5% CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后進行首次換液。

1.4.2H/R模型的建立 將細胞接種在培養(yǎng)瓶中待其生長至90%左右時，按照分組加入含有合適濃度藥物的培養(yǎng)基，然后置于5% CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h；待培養(yǎng)結束后取出培養(yǎng)瓶，棄去含藥培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，再加入預先配制好的缺氧液，再將其放入含95% N2和5% CO2的三氣培養(yǎng)箱中進行缺氧5 h，缺氧時間結束后將缺氧液換成正常的完全培養(yǎng)基再置于 5% CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。

1.4.3CCK-8檢測原代大鼠心肌細胞活力 用胰酶消化收集對數(shù)生長時期的細胞懸液，取合適濃度的細胞懸液加入96孔板中，每孔加入200 μl，待其長至90%左右后造模；結束后向每孔加入10 μl CCK-8溶液；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1～4 h；用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.4.4LDH檢測 用胰酶消化收集對數(shù)生長時期的細胞懸液，取合適濃度的細胞懸液加入96孔板中，每孔加入200 μl，每組設置6個復孔，待其長至90%左右后造模，結束后吸取每孔上清液液進行LDH測定。

1.4.5DCFH-DA檢測細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平 用胰酶消化收集對數(shù)生長時期的細胞懸液，取合適濃度的細胞懸液加入24孔板中，每孔加入500 μl；待其長至90%左右造模，結束后加入DCFH-DA溶液，孵育0.5 h后拍照觀察。

1.4.6自噬雙標腺病毒轉染原代心肌細胞 將生長狀態(tài)良好的原代心肌細胞接種到24孔板中，并且使細胞濃度在1×105/ml左右，待其長至50%～70%時，加入mRFP-GFP-LC3，感染2 h時后將培養(yǎng)基換成正常的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待病毒感染24 h后可以觀察到GFP以及RFP的表達情況。48 h后先用藥物孵育1 h后再進行H/R模型的建立，待造模結束后將細胞進行固定以及封片)，最后進行拍照分析。

1.4.7Western blot檢測相關蛋白表達水平 采用Western blot分別檢測大鼠缺血再灌注損傷心臟中LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin 1與P62蛋白表達的變化。用Bioshine ChemiQ 4600熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，用Image J圖像分析軟件分析，計算蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 牡荊素對大鼠原代心肌細胞活力的影響對原代心肌細胞正常培養(yǎng)后，觀察不同濃度牡荊素(1、3、10、30、50、100、300、500 μmol/L)對其細胞活力的影響，結果顯示，不同濃度的牡荊素與心肌細胞共同培養(yǎng)24 h后，3、10、30 μmol/L牡荊素可提高心肌細胞的活力，隨著牡荊素濃度的增加心肌細胞活力降低，但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，結果見圖1。

圖1 牡荊素對正常培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞活力的影響(n=6)

2.2 牡荊素對H/R損傷心肌細胞活力和LDH釋放量的影響與正常對照組比較，H/R組原代心肌細胞活力降低為(58.02±6.71)%(F=20.91，P<0.01)，LDH釋放量增多為(0.81±0.06)(F=53.62，P<0.01)，提示心肌細胞損傷加重；與H/R組比較，牡荊素3、10 μmol/L給藥組可明顯提高H/R后心肌細胞活力，抑制心肌細胞LDH的釋放。結果見圖2。

2.3 牡荊素對H/R損傷心肌細胞內ROS水平的影響DCFH-DA檢測結果顯示，與正常對照組比較，缺氧復氧誘導后H/R組心肌細胞內ROS水平明顯上升，其相對熒光密度值為(3.28±0.45)(F=63.97，P<0.01)；與H/R組比較，牡荊素3、10 μmol/L給藥組可明顯抑制H/R后心肌細胞內ROS的產生。結果見圖3。

2.4 牡荊素對H/R損傷后心肌細胞自噬及自噬流的影響mRFP-GFP-LC3結果顯示，與正常對照組比較，缺氧復氧誘導后H/R組心肌細胞出現(xiàn)明顯的自噬和自噬流增強，并且心肌細胞LC3Ⅱ蛋白表達增加(F=16.11，P<0.01)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大，提示H/R后心肌細胞中自噬小體累積增加，自噬溶酶體隨之增多；而牡荊素各劑量組可抑制H/R后心肌細胞的自噬和自噬流增強，LC3Ⅱ蛋白表達減少，LC3Ⅱ/Ⅰ比值減小，心肌細胞內自噬小體的累積受抑制。結果見圖4。

圖2 牡荊素對H/R損傷心肌細胞活力和LDH釋放量的影響(n=6)

圖3 牡荊素對H/R損傷心肌細胞內ROS水平的影響(n=6)

圖4 牡荊素對H/R損傷后心肌細胞自噬及自噬流的影響(n=4)

2.5 牡荊素對H/R損傷后心肌細胞自噬相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示，與正常對照組比較，缺氧復氧誘導后H/R組心肌細胞中自噬蛋白Beclin 1上調(F=9.14，P<0.01)、而P62蛋白表達降低(F=10.96，P<0.01)，與H/R組比較，牡荊素給藥組可抑制H/R后心肌細胞Beclin 1蛋白表達，同時上調P62蛋白表達，結果見圖5。

3 討論

心血管疾病是當今嚴重威脅人類健康的主要殺手，其發(fā)病率和死亡率均占據(jù)首位[6]。深入研究其病理生理機制以及尋找有效的防治藥物是一項緊迫的課題。牡荊素是一種天然的類黃酮化合物，是從干燥的山楂葉中提取分離的有效單體成分，具有許多重要的生物學活性[7-8]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牡荊素對心腦血管具有保護作用[4-5,9]，但對其保護作用機制仍不清楚。本實驗在前期研究基礎上進一步探討牡荊素對心肌細胞缺氧復氧損傷的潛在作用機制。心肌缺氧復氧時內源性ROS產生過度蓄積可導致細胞脂質過氧化損傷，細胞膜和線粒體受損破壞，細胞自噬增強，進一步導致細胞凋亡、壞死。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，在原代心肌細胞H/R模型上，缺氧復氧誘導后心肌細胞活力下降、LDH釋放增多，ROS水平升高，而牡荊素可提高缺氧復氧心肌細胞活力，抑制LDH的釋放，同時可抑制心肌細胞ROS的產生。

圖5 牡荊素對H/R損傷后心肌細胞自噬相關蛋白表達的影響(n=4)

自噬是細胞一種自我調節(jié)胞內代謝的過程，以實現(xiàn)細胞自我更新、促進生存和應對輕微應激，但過度應激可導致自噬增強，自噬體累積，并產生過度自噬而引發(fā)細胞自我消化死亡[10-11]。Beclin1是自噬起始階段的關鍵調控蛋白，可促進自噬體膜形成，誘導自噬發(fā)生[12-13]。LC3B是一種特殊的蛋白質，其表達增加與自噬誘導有關，是自噬體形成的重要標志。P62蛋白反映自噬活性，其可與自噬小體內膜上LC3Ⅱ形成復合物，被自噬溶酶體降解。過度自噬時P62蛋白不斷被降解，自噬減弱時，P62蛋白降解減少，胞質中蓄積增多。心肌缺血再灌注損傷是一種強應激反應，可能導致心肌細胞自噬增強，自噬體累積，自噬相關蛋白Beclin1、LC3B表達增加而產生過度自噬，導致細胞死亡[14-15]。本研究結果顯示，心肌細胞H/R后出現(xiàn)明顯的自噬和自噬流增強，并且心肌細胞LC3Ⅱ蛋白表達增加，LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大，Beclin1蛋白表達上調，P62蛋白表達降低，提示H/R后心肌細胞中自噬體累積增多，自噬溶酶體增加，加重細胞損傷。牡荊素可抑制H/R后心肌細胞的自噬和自噬流增強，LC3Ⅱ蛋白表達減少，LC3Ⅱ/Ⅰ比值減小，Beclin1蛋白表達減少，P62蛋白表達增加，從而抑制心肌細胞內自噬體的累積，減輕心肌細胞的損傷。