程曉敏，丁一楠，姬 強(qiáng)，馮 成，饒德法，劉曉穎

中國是食管癌發(fā)病率和死亡率較高的國家，亟需更有效的診斷及預(yù)后指標(biāo)。組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDAC)對(duì)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控有重要作用。正常細(xì)胞中，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HAT)與HDAC共同調(diào)節(jié)組蛋白的乙酰化和去乙?；?，而在惡性腫瘤細(xì)胞中這種平衡會(huì)被打破，進(jìn)而影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)等[1-2]。核心組蛋白N末端的可逆修飾是重構(gòu)高級(jí)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及控制基因表達(dá)的主要表觀遺傳機(jī)制[3]。HDAC抑制劑所導(dǎo)致的開放染色質(zhì)可上調(diào)或抑制基因表達(dá)。已知FK506結(jié)合蛋白3(FK506 binding protein 3, FKBP3)可通過HDAC2/SP1/p27這一通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖能力[4]，但尚無證據(jù)表明HDAC抑制劑可以調(diào)節(jié)FKBP3。該研究從食管癌細(xì)胞入手，探索多種HDAC抑制劑對(duì)FKBP3的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步揭示FKBP3/HDACs在腫瘤中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1主要試劑 二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購于德國Sigma-Aldrich公司；抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)、恩替諾特(MS-275)、MC1568和地西他濱(5-AZA)購于上海Selleck公司；胎牛血清購于以色列Biological Industries公司；RPMI-1640和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國GE公司；胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素混合液、Western及IP細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Western一抗稀釋液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine RNAi MAX試劑購于美國Thermo-Fisher公司；Total RNA提取試劑盒購于美國Omega公司；NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、NovoStart?SYBR qPCR試劑盒 購于江蘇近岸蛋白公司；FKBP3抗體購于英國Abcam公司；HDAC1、HDAC2、HDAC3、beta-actin抗體購于武漢Proteintech公司。

1.1.2主要儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(VIOS 160i)、BSC-2級(jí)生物安全柜(1300)、微量分光光度計(jì)(NanoDrop)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Quant studio 6 Flex)(美國Thermo-Fischer公司)；倒置光學(xué)顯微鏡(TS-100，日本株式會(huì)社尼康)；高速冷凍離心機(jī)(Microfuge 20R，美國Beckman Coulter公司)；恒壓電泳儀(PowerPacTMBasic，美國BIO-RAD公司)；微型垂直電泳槽(VE-180，上海天能科技)。

1.1.3siRNA和qPCR引物 HDAC siRNA和陰性對(duì)照siRNA合成于上海吉瑪生物科技有限公司，序列見表1。qPCR引物合成于通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司，序列見表2。

1.1.4細(xì)胞 食管癌細(xì)胞系ECA109和KYSE30為本實(shí)驗(yàn)室保存。

表2 qPCR引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和加藥實(shí)驗(yàn) ECA109和KYSE30細(xì)胞系使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)；培養(yǎng)的細(xì)胞每1～2 d換液1次，細(xì)胞密度大于90%時(shí)進(jìn)行傳代，使用胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，以培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)并計(jì)數(shù)。加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，按照3×105個(gè)/孔的數(shù)量接種于12孔板，待細(xì)胞貼壁生長穩(wěn)定后，在培養(yǎng)基中加入藥物：SAHA(終濃度為4 μmol/L，下同)、MS-275(5 μmol/L)、MC1568(5 μmol/L)、5-AZA(5 μmol/L)；設(shè)置未處理和陰性對(duì)照(加入1 ∶1 000 的DMSO)組；連續(xù)培養(yǎng)48 h后，胰酶消化并收集細(xì)胞。

1.2.2siRNA knockdown實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前1 d，將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔的數(shù)量接種于6孔板。次日觀察貼壁后，使用Opti-MEM以50 nmol/L的終濃度稀釋siRNA儲(chǔ)液；再以1 ∶1的比例稀釋Lipofectamine RNAi MAX試劑，將二者混勻，靜置15 min；棄盡培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入上述混合轉(zhuǎn)染液繼續(xù)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化并收集細(xì)胞以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 使用Total RNA 提取試劑盒對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度；按試劑盒要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA保存于-80 ℃；按試劑盒要求進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，并以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法分析相對(duì)基因表達(dá)，計(jì)算各組mRNA的相對(duì)含量。

1.2.4Western blot 加入適量Western細(xì)胞裂解液裂解收集的細(xì)胞，冰浴30 min；4 ℃、14 000 r/min離心20 min；收集上清液，Bradford法進(jìn)行總蛋白濃度測(cè)定；各取30 μg總蛋白樣品，沸水浴5 min變性，SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白于PVDF膜；5%脫脂牛奶于室溫封閉1.5 h，TBST室溫洗膜3次，每次10 min；一抗孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次；室溫孵育二抗1.5 h，TBST洗膜3次；ECL顯影液顯影。使用ImageJ軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)進(jìn)行條帶的光密度分析，并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算FKBP3的相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 HDAC抑制劑抑制食管癌細(xì)胞FKBP3的表達(dá)對(duì)培養(yǎng)的ECA109和KYSE30細(xì)胞進(jìn)行HDAC抑制劑加藥處理，Western blot結(jié)果顯示SAHA和MS-275處理48 h后，F(xiàn)KBP3的蛋白含量有所降低，而MC1568、5-AZA和DMSO處理后的細(xì)胞，其FKBP3的含量沒有明顯變化。使用ImageJ對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行測(cè)定，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析，對(duì)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行匯總，同時(shí)以DMSO組的數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)，制作加藥后FKBP3蛋白相對(duì)含量的直方圖(圖1)。依據(jù)圖1的數(shù)據(jù)，HDAC抑制劑SAHA及MS-275處理48 h對(duì)ECA109細(xì)胞及KYSE30細(xì)胞中的FKBP3蛋白表達(dá)有一定的抑制作用，但統(tǒng)計(jì)分析該結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

經(jīng)qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FKBP3的mRNA水平同樣被SAHA和MS-275所抑制(圖2)。在ECA109細(xì)胞中，經(jīng)2-ΔΔCt法分析后，F(xiàn)KBP3的mRNA含量為DMSO：(0.039±0.003)；SAHA：(0.020±0.001)；MS-275：(0.017±0.005)。在KYSE30細(xì)胞中為DMSO：(0.022±0.001)；SAHA：(0.008±0.001)；MS-275：(0.009±0.001)。這說明SAHA和MS-275對(duì)于FKBP3的抑制作用起始于mRNA水平。鑒于SAHA是廣譜的HDAC抑制劑，而MS-275特異性抑制HDAC1和HDAC3，提示HDAC對(duì)FKBP3表達(dá)的影響，可能主要是通過HDAC1發(fā)揮作用的。

圖1 Western blot法檢測(cè)HDAC抑制劑處理后食管癌細(xì)胞FKBP3表達(dá)

圖2 qPCR檢測(cè)HDAC抑制劑對(duì)食管癌細(xì)胞FKBP3 mRNA水平的影響

2.2 HDAC1和HDAC2調(diào)節(jié)FKBP3的表達(dá)為了進(jìn)一步確定FKBP3被HDAC調(diào)控的具體機(jī)制，在ECA109細(xì)胞中進(jìn)行了HDAC1、HDAC2、HDAC3的siRNA敲低實(shí)驗(yàn)。經(jīng)qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，對(duì)比陰性對(duì)照組(siNC)，3種siRNA敲低組的對(duì)應(yīng)HDAC基因的mRNA的相對(duì)含量均減少60%以上(圖3)。Western blot結(jié)果顯示，HDAC1和HDAC2敲低的細(xì)胞中，F(xiàn)KBP3的蛋白表達(dá)受到一定程度的抑制，而HDAC3的敲低對(duì)FKBP3沒有明顯影響(圖4)。該結(jié)果表明，HDACs對(duì)FKBP3的調(diào)控很可能是通過HDAC1或HDAC2實(shí)現(xiàn)。

2.3 對(duì)FKBP3和HDAC相互作用的預(yù)測(cè)在STRING數(shù)據(jù)庫中檢索人類FKBP3相互作用蛋白(圖5)。圖5中顯示與FKBP3相互作用置信度最高的10個(gè)蛋白，HDAC2和HDAC1蛋白分別位于FKBP3相互作用列表的第1、2位，得分分別為0.958和0.954分(分?jǐn)?shù)區(qū)間為0～1分，1分代表相互作用程度最高)；FKBP3和HDAC2、HDAC1的相互作用，均獲得了直接實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)資料庫的支持。并且，根據(jù)NCI-Nature Pathways Interaction Database數(shù)據(jù)庫，F(xiàn)KBP3、HDAC1、HDAC2 這3個(gè)蛋白可以作為一個(gè)復(fù)合體，共同發(fā)揮生物學(xué)功能。其他諸如CSNK2A1、YY1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)等蛋白也存在于該相互作用網(wǎng)絡(luò)中。

圖3 qPCR檢測(cè)ECA109細(xì)胞中HDAC siRNA的敲低效果

圖4 ECA109細(xì)胞中HDAC siRNA敲低后的

圖5 STRING數(shù)據(jù)庫中FKBP3的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

3 討論

組蛋白乙酰化是基因表達(dá)的重要決定因素。乙酰化通常與轉(zhuǎn)錄活化有關(guān)，而去乙?；慕M蛋白通常與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。HDAC是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以從核心組蛋白中去除乙酰基。已有研究表明在結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中存在HDAC的異常表達(dá)[5]。

近年來，隨著研究的深入和臨床試驗(yàn)的推進(jìn)，HDAC抑制劑已被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的治療中[6]，如美國FDA于2006年批準(zhǔn)SAHA用于頑固性T細(xì)胞淋巴瘤，于2014年批準(zhǔn)PXD101用于周圍性T細(xì)胞淋巴瘤。本研究結(jié)果表明，SAHA和MS-275不僅可以調(diào)節(jié)HDAC的水平，還可以調(diào)節(jié)HDAC相互作用蛋白FKBP3，并且SAHA和MS-275對(duì)于FKBP3的調(diào)節(jié)作用是在mRNA水平發(fā)揮作用的。進(jìn)一步研究顯示，F(xiàn)KBP3蛋白受HDAC調(diào)節(jié)主要來自于HDAC1和HDAC2，而非HDAC3。本研究中，經(jīng)SAHA和MS-275處理后的食管癌細(xì)胞，對(duì)FKBP3的mRNA抑制效應(yīng)比蛋白水平更顯著，推測(cè)可能是蛋白水平的變化存在滯后性，以及FKBP3的翻譯后修飾增強(qiáng)了蛋白的穩(wěn)定性。

FKBP3是PPIase超家族的一員，其蛋白的C端是FKBP家族共有的PPIase結(jié)構(gòu)域，并且也是FK506結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與免疫抑制劑FK506、雷帕霉素(Rapamycin)均可結(jié)合。在哺乳動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)的18種FKBPs中，F(xiàn)KBP3和Rapamycin的結(jié)合能力僅次于FKBP12，已證明FKBP3的FRB區(qū)域可以通過Rapamycin在活細(xì)胞中產(chǎn)生物理結(jié)合[7]，這為FKBP3結(jié)合并影響mTOR提供了依據(jù)。mTOR作為磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)相關(guān)激酶，參與許多細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期相關(guān)的重要調(diào)節(jié)功能，包括在PI3K/Akt通路的下游發(fā)揮作用并被磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)4E-BP1和70S核糖體蛋白6激酶(p70 S6K)通路。mTOR在腫瘤組織中的表達(dá)也明顯高于正常組織，是研究腫瘤發(fā)生和開發(fā)新型抗腫瘤藥物的重點(diǎn)靶點(diǎn)。乙?；潜碛^遺傳修飾的重要機(jī)制，組蛋白的乙?；话惆殡S基因的活化，有報(bào)道稱Rapamycin抑制mTOR后可以使Esa1酶從核糖體蛋白基因的啟動(dòng)子釋放，導(dǎo)致組蛋白H4去乙酰化[8]。mTOR和HDACs的關(guān)系密切，PI3K/AKT/mTOR通路調(diào)節(jié)HDAC3 S424的磷酸化，從而促進(jìn)HDAC3和磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1, PGK1)相互作用及PGK1 K220去乙?；痆9]。Rapamycin和MS-275聯(lián)用也被報(bào)道在多種癌癥治療中有效，可顯著下調(diào)MYC和E2F1的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長[10]?；贔KBP3對(duì)Rapamycin有較強(qiáng)的結(jié)合能力，提示FKBP3在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮作用，可能為潛在的腫瘤藥物靶點(diǎn)。

STRING數(shù)據(jù)庫整合了基因組背景、高通量測(cè)序、共表達(dá)、已發(fā)表文本挖掘和其他數(shù)據(jù)庫內(nèi)容[11]。該數(shù)據(jù)庫的結(jié)果進(jìn)一步預(yù)測(cè)了HDAC1、HDAC2和FKBP3之間的相互作用，并且提示這三者可能共同組成復(fù)合物發(fā)揮作用。綜上，本研究表明，HDAC抑制劑可能在mRNA水平調(diào)節(jié)FKBP3的表達(dá)，而且很可能通過HDAC1、HDAC2實(shí)現(xiàn)的，具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。