陳鶴丹，林 煊，謝 穎，陳 堯，楊君儀,王 赟,3,張世超，胡祖權(quán)，曾 柱,3,4，劉麗娜,4

信使RNA(messenger RNA, mRNA)疫苗是近年來受到廣泛關(guān)注的有潛力的抗腫瘤免疫治療策略，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展增強(qiáng)了體外轉(zhuǎn)錄mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率的提高[1]，此外，mRNA疫苗還具有合成簡便、價(jià)格較低、安全性好、能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。黑色素瘤抗原A3(melanoma antigen family A3, MAGE-A3) 是一種腫瘤-睪丸抗原(cancer-testis antigens, CTA)，在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)，在腫瘤患者中，MAGE-A3能同時(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[4]。多個(gè)以MAGE-A3為基礎(chǔ)的疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但試驗(yàn)結(jié)果提示需要在疫苗設(shè)計(jì)、佐劑選擇等方面開展研究[4]。因此，該研究通過構(gòu)建編碼MAGE-A3 基因的真核表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)錄獲得含5′抗反向帽類似物(anti-reverse cap analog, ARCA)帽、3′Poly(A)尾的修飾的MAGE-A3 mRNA，并實(shí)現(xiàn)MAGE-A3 mRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞NIH/3T3中的翻譯和表達(dá)，為MAGE-A3 mRNA疫苗的體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑pcDNA3. 1(+)質(zhì)粒、感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)為實(shí)驗(yàn)室保存；NIH/3T3細(xì)胞、4T1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫; Anti-β-tubulin抗體購自英國Abcam 公司; HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG抗體、Anti-MAGE-A抗體購自美國 Santa Cruz 公司; Opti-MEM無血清培養(yǎng)基購自美國 Gbico 公司; 胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司; TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、瓊脂糖、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoR I、XhoI限制性內(nèi)切酶購自日本TaKaRa 公司；MEGAscriptTMT7試劑盒、 MEGAclearTM試劑盒、poly(A)尾試劑盒購自美國Ambion 公司; TransIT?-mRNA試劑盒購自美國 Mirus 公司; ARCA帽購自美國NEB公司; 修飾核苷酸購自美國TriLink Bio Tech公司; 引物合成和質(zhì)粒DNA測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1三陰型乳腺癌4T1細(xì)胞總RNA提取 將三陰型乳腺癌4T1細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞生長匯合度達(dá) 80%～90%時(shí)，采用TRIzol試劑法提取4T1細(xì)胞總RNA，最后用15 μl DEPC水溶解RNA沉淀。

1.2.2MAGE-A3基因的擴(kuò)增及回收 以含MAGE-A3基因全長的4T1 cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 20 s，30 個(gè)循環(huán)后72 ℃ 延伸10 min終止。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后得到MAGE-A3目的片段。MAGE-A3基因上游引物：5′-GTGGAATTCGCCACCATGGCTGATTCCC AT-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-ATACTCGAGCTAGAATGTGTGTAGGT-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

1.2.3重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MAGE-A3的構(gòu)建及鑒定 分別對PCR回收產(chǎn)物和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切。雙酶切后用切膠回收試劑盒回收酶切片段，將回收片段用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過夜后挑選陽性單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進(jìn)行單/雙酶切1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，對其進(jìn)行測序確認(rèn)重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。

1.2.4體外轉(zhuǎn)錄修飾的MAGE-A3 RNA、加尾及純化 以上述pcDNA 3.1(+)/MAGE-A3重組質(zhì)粒作為體外轉(zhuǎn)錄模板，使用修飾核苷酸代替MEGAscriptTMT7試劑盒內(nèi)的胞苷和尿苷，添加ARCA，按體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成RNA后添加Poly(A)尾，最后按照清除試劑盒說明書對產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.5純化的MAGE-A3 mRNA轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞 將NIH/3T3細(xì)胞鋪于六孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80%后，用TransIT?-mRNA試劑盒轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.2.6Western blot檢測MAGE-A3蛋白的表達(dá) 收集目的細(xì)胞，分別取20 μg細(xì)胞總蛋白樣品，恒壓140 V進(jìn)行蛋白電泳2 h，在低溫恒流250 mA的條件下，轉(zhuǎn)膜1 h。50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜。Anti-MAGE-A抗體和Anti-β-tubulin抗體一抗(1 ∶1 000)4 ℃ 過夜后，室溫孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG二抗(1 ∶5 000)1 h。使用凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1 三陰型乳腺癌4T1細(xì)胞提取總RNA瓊脂糖凝膠電泳通過TRIzol試劑從4T1乳腺癌細(xì)胞中提取得到總RNA樣品，取2 μl RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。圖1可見提取的總RNA條帶分別為28、18、5 s(s為沉降系數(shù))，說明提取的總RNA符合后續(xù)要求。

圖1 三陰型乳腺癌4T1細(xì)胞提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳M: DL 2 000 DNA Marker; 1: 4T1細(xì)胞總RNA

2.2 RT-PCR擴(kuò)增MAGE-A3基因PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取9 μl PCR樣品，加入1 μl 10×Loading Buffer，混勻后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。由圖2可看出PCR擴(kuò)增的特異性條帶在1 000 bp左右，與預(yù)期相符，表明成功擴(kuò)增MAGE-A3基因。

圖2 PCR擴(kuò)增MAGE-A3瓊脂糖凝膠電泳M: DL 8000 DNA Marker; 1、2: MAGE-A3 PCR產(chǎn)物

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定和測序分析挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，待酶切過夜后，取出。然后加入1 μl 10×Loading Buffer，混勻之后，進(jìn)行電泳。由圖3可見，只有2號質(zhì)粒雙酶切后出現(xiàn)一條1 000 bp左右的目的基因條帶和一條 4 000～5 000 bp的載體條帶，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 體外轉(zhuǎn)錄mRNA的檢測經(jīng)Thermo Nano DropTM2000測定的體外轉(zhuǎn)錄mRNA A260/A280比值為1.92，mRNA濃度為872.3 ng/μl。 最后將轉(zhuǎn)錄模板DNA與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從圖4可看出，轉(zhuǎn)錄模板條帶在1 000 bp左右，mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物條帶在500 bp左右，因?yàn)槟０錎NA為雙鏈結(jié)構(gòu)，而轉(zhuǎn)錄得到的mRNA為單鏈，轉(zhuǎn)錄得到的mRNA理論上應(yīng)該為雙鏈DNA的一半。

圖3 重組質(zhì)粒單/雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳M: DL 8000 DNA Marker；1、2、3: 重組質(zhì)粒的單/雙酶切產(chǎn)物

圖4 體外轉(zhuǎn)錄mRNA的瓊脂糖凝膠電泳M: DL 2000 DNA Marker；1: 轉(zhuǎn)錄模板DNA；2: 體外轉(zhuǎn)錄mRNA

2.5 體外轉(zhuǎn)錄MAGE- A3 mRNA在NIH/3T3細(xì)胞中的表達(dá)將體外轉(zhuǎn)錄MAGE-A3 mRNA 轉(zhuǎn)染到NIH/3T3 細(xì)胞后培養(yǎng) 48 h，提取對照組NIH/3T3細(xì)胞及轉(zhuǎn)染MAGE-A3 mRNA的NIH/3T3 細(xì)胞總蛋白。圖5結(jié)果表明MAGE-A3 mRNA成功轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細(xì)胞中，對照組與轉(zhuǎn)染組之間MAGE-A3的表達(dá)存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 Western blot法檢測 MAGE-A3蛋白的表達(dá)A: 對照組; B: 轉(zhuǎn)染MAGE-A3 mRNA組；與對照組比較：**P<0.01

3 討論

mRNA在革新疫苗、替代蛋白療法和遺傳性疾病的治療等方面表現(xiàn)出巨大潛力[5]。在腫瘤治療研究方面，有將mRNA直接注射到淋巴結(jié)內(nèi)，在淋巴結(jié)內(nèi)啟動(dòng)幼稚T細(xì)胞，能有效誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[6]；也有將mRNA瘤內(nèi)注射，直接作用于經(jīng)樹突狀細(xì)胞活化、遷移并浸潤腫瘤的腫瘤浸潤T細(xì)胞，以及利用mRNA編碼的免疫調(diào)節(jié)因子在腫瘤內(nèi)的表達(dá)，去改善抑制性的腫瘤微環(huán)境[7-8]；此外，瘤內(nèi)注射編碼腫瘤抗原的mRNA可以直接活化已經(jīng)負(fù)載死亡腫瘤細(xì)胞釋放的腫瘤抗原、駐留腫瘤的樹突狀細(xì)胞[9]。自2008年起，大量的mRNA腫瘤疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)[6]。因此，本研究構(gòu)建編碼腫瘤特異性抗原MAGE-A3的體外轉(zhuǎn)錄mRNA，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中證實(shí)體外轉(zhuǎn)錄MAGE-A3 mRNA能正常翻譯表達(dá)，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究MAGE-A3 mRNA疫苗的抗腫瘤效果奠定了基礎(chǔ)。

mRNA應(yīng)用于治療，它的可翻譯性、穩(wěn)定性以及免疫刺激活性是關(guān)鍵因素，通常針對這幾點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)[10]。mRNA 5′端帽子會(huì)影響翻譯起始因子eIF4E的識別，對帽子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，可抑制RNA去帽和增強(qiáng)mRNA抵抗酶降解的能力，進(jìn)而提高mRNA的翻譯效率[11]。目前帽類似物中使用ARCA用于合成體外轉(zhuǎn)錄mRNA，可提高mRNA的翻譯效率[12]。RNA堿基的化學(xué)修飾可增強(qiáng)mRNA的免疫刺激活性，在mRNA疫苗設(shè)計(jì)中很重要[13]。Poly(A)尾，將其長度增加至約120個(gè)A，可提高mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)量[6]。最適翻譯的體外轉(zhuǎn)錄mRNA的合成，通常以線性DNA為模板，使用T7噬菌體RNA聚合酶進(jìn)行體外合成[14]，合成得到的mRNA分子包含5′帽子結(jié)構(gòu)、目的基因的完整開放閱讀框、3′Poly(A)尾[13]。本研究體外轉(zhuǎn)錄合成的就是含5′ARCA帽、3′Poly(A)尾的修飾的MAGE-A3 mRNA。

Kozak序列是一段位于真核生物基因翻譯起始密碼子周圍的核酸序列，在翻譯起始中發(fā)揮重要的識別作用。脊椎動(dòng)物mRNA的Kozak序列多數(shù)為GCC R CC AUG G(此處R為A/G)。起始密碼子AUG的A為+1，其上游的C為-1。已證實(shí)-3位為嘌呤堿基A時(shí)，+4位為G對上調(diào)蛋白表達(dá)起關(guān)鍵作用[15]。因此，在MAGE-A3 mRNA 5′端設(shè)計(jì)了GCCACCAUGG序列以增強(qiáng)MAGE-A3 mRNA翻譯效率。

本研究設(shè)計(jì)的體外轉(zhuǎn)錄MAGE-A3 mRNA能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)腫瘤特異性抗原MAGE-A3蛋白，為后續(xù)研究該mRNA疫苗的免疫效果奠定了基礎(chǔ)。