李健，高興祥，李美，房鋒

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東濟(jì)南 250100）

紫花苜蓿（Medicago sativa）為豆科苜蓿屬多年生草本植物，是我國(guó)種植面積最大的牧草，同時(shí)也是世界范圍內(nèi)種植時(shí)間最久的重要牧草之一［1，2］。在長(zhǎng)期種植過(guò)程中，紫花苜蓿病害呈現(xiàn)出多樣性和危害性增強(qiáng)的趨勢(shì)，如根腐病和褐斑病等病害對(duì)紫花苜蓿產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。世界范圍內(nèi)，每年由病害導(dǎo)致苜蓿產(chǎn)量損失在20%以上［3］。目前苜蓿病害防控主要使用化學(xué)殺菌劑，雖對(duì)降低病害、苜蓿產(chǎn)量起到重要作用，但長(zhǎng)期使用，不僅導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，而且對(duì)苜蓿品質(zhì)、安全、環(huán)境健康產(chǎn)生威脅［3-5］。因此，對(duì)于環(huán)境友好型微生物生防資源的需求越來(lái)越迫切。

植物內(nèi)生菌是指一類存在于植物體組織內(nèi)，但是并不引起生物病害的一類微生物的總稱［6］。研究顯示，植物內(nèi)生菌功能復(fù)雜，部分內(nèi)生菌對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育起到一定的保護(hù)作用，在植物抵御病害過(guò)程中扮演重要角色［7，8］。植物內(nèi)生菌類群多樣，主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌等，其中芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）是目前研究及應(yīng)用較多的一類生防細(xì)菌。該類細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中往往能夠通過(guò)代謝產(chǎn)物達(dá)到抑制植物病原菌生長(zhǎng)的目的［9，10］。本研究從苜蓿中分離得到一株內(nèi)生細(xì)菌Ba09，并對(duì)其進(jìn)行分類鑒定和抑菌效果分析，為下一步開(kāi)展苜蓿病害生物防治積累微生物菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株與樣品采集 樣品采集于山東省農(nóng)業(yè)工程學(xué)院齊河院區(qū)苜蓿試驗(yàn)園，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行分離。

供試植物病原菌菌株：炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata），均保存于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 15 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫花苜蓿內(nèi)生菌的分離 紫花苜蓿葉片用清水反復(fù)沖洗干凈、晾干；超凈工作臺(tái)內(nèi)，75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3遍，5%次氯酸鈉表面消毒3 min，無(wú)菌水沖洗3遍，晾干。將表面消毒后的葉片置于NA培養(yǎng)基平板上，光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察，并將產(chǎn)生的菌落轉(zhuǎn)移到新的NA培養(yǎng)基中。對(duì)照用組織印記法檢測(cè)表面消毒效果。

1.2.2 生防效果測(cè)定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法［11］測(cè)定菌株對(duì)待測(cè)病原菌的拮抗作用。對(duì)峙培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)量對(duì)照的菌落直徑（mm）和對(duì)峙培養(yǎng)菌落直徑（mm）并計(jì)算抑制率。抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑-對(duì)峙培養(yǎng)菌落直徑）／對(duì)照菌落直徑×100。顯微鏡下觀察對(duì)峙培養(yǎng)病原菌邊緣菌絲狀態(tài)。

1.2.3 菌株的鑒定 NA培養(yǎng)基活化 Ba09菌株，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)、顏色、凸起特征、邊緣狀態(tài)等。用TaKaRa細(xì)菌基因組提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit）提取基因組 DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和F1541（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）擴(kuò)增16S rRNA序列。擴(kuò)增體系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，引物各 1μL，Taq酶0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 18μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min?；厥?PCR產(chǎn)物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似序列，采用MEGA 6.0和ClustalW進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

經(jīng)NA培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌株菌落不規(guī)則，整體近圓形，菌落邊緣不整齊，上生皺褶，無(wú)光澤。擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 469 bp的16S rRNA序列。BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Ba09菌株的16S rRNA序列與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌等芽孢桿菌屬序列同源性在99%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖1）顯示，Ba09菌株與解淀粉芽孢桿菌親緣關(guān)系更近，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖1 菌株Ba09系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.2 Ba09菌株的生防效果

2.2.1 抑菌效果 對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，Ba09菌株對(duì)待測(cè)病原菌均表現(xiàn)出不同程度的拮抗性（圖2），抑制率在43.11% ～77.19%之間，其中對(duì)炭疽菌抑制效果最好，對(duì)鐮刀菌抑制效果相對(duì)較差（表1）。

表1 Ba09對(duì)供試病原菌的抑制率

圖2 菌株Ba09對(duì)供試病原菌的抑制效果

2.2.2 病原菌顯微觀察 顯微觀察顯示，Ba09菌株對(duì)待測(cè)病原菌均表現(xiàn)出不同程度的拮抗性，在未發(fā)生菌落直接接觸的情況下，供試病原菌的菌絲生長(zhǎng)受抑制并出現(xiàn)扭曲、頂端呈球狀膨大等現(xiàn)象（圖3）。

圖3 菌株Ba09抑菌顯微觀察

3 討論與結(jié)論

目前主要通過(guò)使用化學(xué)藥劑開(kāi)展植物病害防控，不僅容易造成高抗性病原菌的產(chǎn)生，而且對(duì)生態(tài)環(huán)境也會(huì)造成污染。近年來(lái)，基于農(nóng)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的需求，通過(guò)代謝物抑菌或通過(guò)誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性防治植物病害的環(huán)境安全型生物菌劑得到越來(lái)越多的重視。芽孢桿菌屬細(xì)菌在自然界廣泛存在，其生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)生的芽孢抗逆能力強(qiáng)，能夠在多種環(huán)境下應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中均能產(chǎn)生對(duì)多種植物病原菌具有廣泛抑制作用的物質(zhì)［12］，芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物不但可以直接抑制病原菌的生長(zhǎng)，而且能誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病效應(yīng)［13］。荊卓瓊等［10］研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3對(duì)番茄灰霉病的防控效果較好。胡進(jìn)玲等［14］分離得到的解淀粉芽孢桿菌對(duì)苜蓿的多種病原菌均表現(xiàn)出良好的拮抗作用。

對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中Ba09菌株未與待測(cè)病原菌菌絲體直接接觸，但病原菌均受到不同程度的抑制，菌絲形態(tài)發(fā)生改變等，說(shuō)明Ba09菌株是通過(guò)分泌抗生素物質(zhì)或有毒代謝產(chǎn)物作用于病原菌，從而起到抑菌作用。Basha等［15］研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌抑菌過(guò)程可能與拮抗菌分泌的抗菌肽類或蛋白類物質(zhì)有關(guān)，其中幾丁質(zhì)酶具有溶解植物病原菌細(xì)胞壁的能力，可能是芽孢桿菌拮抗病原菌的重要物質(zhì)之一［16］。

本研究篩選得到一株紫花苜蓿內(nèi)生菌，并鑒定為解淀粉芽孢桿菌。對(duì)峙試驗(yàn)和顯微觀察顯示，其對(duì)多種植物病原菌均表現(xiàn)出良好的拮抗效果，具有一定的生防應(yīng)用潛力，下一步將重點(diǎn)關(guān)注該菌株的抑菌機(jī)理及田間應(yīng)用效果。