周海東，軒玉梅，胡 濤，周姣巖

（上海理工大學(xué) 環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093）

藍(lán)藻通常是富營養(yǎng)化湖泊浮游植物的優(yōu)勢種［1］，大規(guī)模的藍(lán)藻水華降低了水資源利用效能，引起嚴(yán)重的生態(tài)破壞及巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，藍(lán)藻優(yōu)勢形成的機(jī)理已經(jīng)成為湖沼學(xué)研究的熱點(diǎn)問題［2］。氮磷是藻類生長過程中所必需的營養(yǎng)元素［3］，它們在水體中的含量直接影響藻類的生長，從而決定了水華的發(fā)生及可能形成的規(guī)模和程度，但對(duì)于氮磷等營養(yǎng)因子具體需要多少量才導(dǎo)致水華的發(fā)生，目前還沒有定論。同時(shí)，在氮磷濃度相近的天然水體中，由于污染物來源、環(huán)境條件、水交換和動(dòng)力條件的不同，會(huì)導(dǎo)致水體中氮磷形態(tài)出現(xiàn)差異。因此，研究不同的氮磷形態(tài)和濃度對(duì)浮游植物生長、繁殖的影響，對(duì)于明確水體中浮游植物優(yōu)勢種和進(jìn)一步探討富營養(yǎng)化水體中藻類暴發(fā)的機(jī)理具有重要意義。

在我國大部分富營養(yǎng)化水體湖泊中，銅綠微囊藻在數(shù)量和發(fā)生頻率上尤占優(yōu)勢［4］，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用光照智能培養(yǎng)箱模擬自然環(huán)境，選擇銅綠微囊藻作為實(shí)驗(yàn)藻種，研究了不同氮磷形態(tài)對(duì)藻類生長的影響，通過對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞密度及葉綠素a 質(zhì)量濃度的實(shí)時(shí)測定來確定藻的生長狀況，研究銅綠微囊藻對(duì)氮磷營養(yǎng)鹽的響應(yīng)，同時(shí)為淡水湖泊中藍(lán)藻水華的暴發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及接種

實(shí)驗(yàn)所用藍(lán)藻為銅綠微囊藻(Microsystems aeruginosa)，購自中國科學(xué)院水生生物研究所（武漢）。藻種在實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提前培養(yǎng)1～2 周，取適量的待接種藻樣以5 000 r·min-1速度離心15 min 后棄去上清液，向其中加入15 mg·L-1的碳酸氫鈉溶液洗滌后再次離心，重復(fù)3～4 次，離心后的藻樣經(jīng)無菌水稀釋后在無菌條件下接種，初始藻細(xì)胞密度約為106個(gè)·mL-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

培養(yǎng)液的配置以BG11 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，首先以BG11 培養(yǎng)基中的NaNO3和K2HPO4為單一的氮源和磷源，質(zhì)量濃度設(shè)置見表1，研究不用氮磷質(zhì)量濃度對(duì)銅綠微囊藻生長的影響。然后依據(jù)NaNO3和K2HPO4對(duì)銅綠微囊藻生長影響的最優(yōu)值研究NH4Cl、NaNO3、NaNO2和K2HPO4、β-G-P、ATP 等不同形態(tài)的氮源和磷源對(duì)銅綠微囊藻生長的影響。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行樣，取平均值。

表 1 氮、磷單因子限制實(shí)驗(yàn)組中的氮、磷質(zhì)量濃度Tab. 1 N and P concentrations under N or P limited conditions (mg·L-1)

實(shí)驗(yàn)容器選用250 mL 三角燒瓶，向其中各裝入培養(yǎng)基100 mL，用1 mol·L-1的HCl 或NaOH調(diào)節(jié)pH 為8.0 ± 0.1，放置于光暗比為12 h:12 h、光照強(qiáng)度為2 000 Lux、溫度為25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為避免光照不均勻，每天手動(dòng)搖動(dòng)4～5 次并將錐形瓶互相交換位置。每隔1 d 按時(shí)取樣，測定銅綠微囊藻的光密度、葉綠素a 質(zhì)量濃度及藻密度。

1.3 分析方法

1.3.1 藻細(xì)胞密度的確定

取一定量的實(shí)驗(yàn)藻種按一定的稀釋倍數(shù)逐級(jí)進(jìn)行稀釋，利用血球計(jì)數(shù)板將稀釋后的藻樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，得到相應(yīng)的藻細(xì)胞數(shù)目。

1.3.2 葉綠素a 質(zhì)量濃度的測定方法

取5 mL 實(shí)驗(yàn)液在5 000 r·min-1下離心5 min，棄去上清液，然后加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇溶液混勻，放置在4 ℃黑暗條件下萃取6～8 h，離心取上清液在723N 分光光度計(jì)上測定665 nm 處的吸光度，根據(jù)式（1）進(jìn)行計(jì)算，即

式中：c為葉綠素a 質(zhì)量濃度；O665nm為波長為665 nm 時(shí)的吸光度。

1.3.3 比增長速率、相對(duì)生長常數(shù)、平均倍增時(shí)間的計(jì)算

比增長速率為

式中：μ為比增長速率；Xn、Xn-1分別為計(jì)數(shù)第n、n-1 天的藻細(xì)胞數(shù)目；Tn、Tn-1分別為對(duì)應(yīng)于Xn、Xn-1的培養(yǎng)天數(shù)。

計(jì)算指數(shù)生長期內(nèi)μ的平均值，將其作為該藻種在某一狀況下μ的估計(jì)值。

相對(duì)生長常數(shù)K為

式中：Ot、O0分別為最終、最初的吸光度；t為培養(yǎng)時(shí)間。

平均倍增時(shí)間G為

2 結(jié)果與討論

2.1 氮、磷質(zhì)量濃度對(duì)銅綠微囊藻生長的影響

采用不同質(zhì)量濃度的NO3--N 和PO43--P 培養(yǎng)基對(duì)銅綠微囊藻進(jìn)行培養(yǎng)，分別測定藻樣中葉綠a 質(zhì)量濃度、藻細(xì)胞密度，以及不同NO3--N質(zhì)量濃度下銅綠微囊藻比增長速率μ、最大比增長速率μmax、相對(duì)生長常數(shù)K和平均倍增時(shí)間G，結(jié)果分別如圖1、2 和表2 所示。圖1（a）中NO3--N 為低濃度時(shí)的銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度低于中、高濃度時(shí)的值；質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1和0.8 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的銅綠微囊藻在第28 天前，生長趨勢基本相同，但在第34 天后，0.2 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組較0.8 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度要高，說明低濃度仍可以保證銅綠微囊藻的正常生長。1.6 mg·L-1較8.0 mg·L-1的銅綠微囊藻的對(duì)數(shù)增長期更長。質(zhì)量濃度為32 mg·L-1明顯比64 mg·L-1培養(yǎng)時(shí)生長趨勢更具優(yōu)勢，但是64 mg·L-1時(shí)在第16～24 天出現(xiàn)了停滯期，在第26 天生物量突然增加，說明其進(jìn)入了第二個(gè)對(duì)數(shù)增長期，并且在兩培養(yǎng)質(zhì)量濃度下最大藻細(xì)胞密度較其余質(zhì)量濃度下的都要大。從圖1（b）中可知，不同NO3--N 質(zhì)量濃度在實(shí)驗(yàn)初期（1～8 天）為銅綠微囊藻適應(yīng)期，葉綠素a 質(zhì)量濃度無明顯區(qū)別。低濃度實(shí)驗(yàn)組中葉綠素a 質(zhì)量濃度明顯低于中、高濃度實(shí)驗(yàn)組的。質(zhì)量濃度為4.0 mg·L-1時(shí)，葉綠素a 質(zhì)量濃度同低濃度實(shí)驗(yàn)組的相似，均處于較低水平；質(zhì)量濃度為8.0 mg·L-1時(shí)，葉綠素a 質(zhì)量濃度在第18 天前并無明顯增加，在第18 天后明顯增加，在第24 天后突然增加，說明其進(jìn)入了第二個(gè)對(duì)數(shù)增長期。高濃度實(shí)驗(yàn)組中葉綠素a 質(zhì)量濃度的變化則一直呈現(xiàn)出顯著增長的趨勢，較其他濃度下的都要大。

圖 1 不同氮質(zhì)量濃度下銅綠微囊藻生長狀況Fig. 1 Growth of Microcystis aeruginosa under different concentrations of nitrogen

由圖2（a）中發(fā)現(xiàn)，低濃度PO43--P 實(shí)驗(yàn)組的最大藻細(xì)胞密度相同，生長曲線相似。質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的最大藻細(xì)胞密度接近，前期的生長曲線趨勢也相似。質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組在第12 天前生長極為緩慢，但在第12 天后細(xì)胞數(shù)量急劇增加。在第14 天前，各濃度下銅綠微囊藻的生長曲線均較為平緩，未出現(xiàn)明顯的快速增長期。但在第14天后，低濃度實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)對(duì)數(shù)增長期。隨著細(xì)胞數(shù)增多，其生長出現(xiàn)了再次的突增，即進(jìn)行了第二次的對(duì)數(shù)增長期［5］。由此看出，實(shí)驗(yàn)組均經(jīng)歷了兩次藍(lán)藻暴發(fā)，表明低濃度的PO43--P 可以使銅綠微囊藻正常生長，而中濃度比高濃度的PO43--P 更能促進(jìn)銅綠微囊藻的生長。圖2（b）中表示在不同濃度下的PO43--P 接種4 天后，各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)入不同程度的對(duì)數(shù)增長期。初期，質(zhì)量濃度為5.4 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的生長趨勢較緩慢，葉綠素a 質(zhì)量濃度較低，銅綠微囊藻處于延滯期，但在第20 天后葉綠素a 質(zhì)量濃度突然增加，進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期。質(zhì)量濃度為0.02 mg·L-1時(shí)，前期葉綠素a 質(zhì)量濃度較高，但在第24 天后，其增長趨勢明顯變緩，說明該濃度在后期無法提供足夠的磷源以促進(jìn)銅綠微囊藻形成葉綠素a；銅綠微囊藻在中、高濃度(0.5～5.4 mg·L-1)時(shí)最大葉綠素a 質(zhì)量濃度比低濃度時(shí)高，說明高濃度的PO43--P 更有利于銅綠微囊藻中葉綠素a 的形成。綜合各PO43--P 濃度下葉綠素a 質(zhì)量濃度的變化，可以得出磷質(zhì)量濃度為0.2、0.5 mg·L-1時(shí)最有利于葉綠素a 的形成，而高濃度(1～5.4 mg·L-1)并不利于葉綠素a 前期的形成［6］，但在后期對(duì)葉綠素a 的形成有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

由表2 中可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著NO3--N質(zhì)量濃度和PO43--P 質(zhì)量濃度的增加，比增長速率增大，相對(duì)生長常數(shù)K 隨著其初始質(zhì)量濃度的提高而上升；而當(dāng)NO3--N 質(zhì)量濃度為 64 mg·L-1時(shí)，PO43--P 質(zhì)量濃度大于 1.0 mg·L-1時(shí)，質(zhì)量濃度的升高對(duì)藻類生長無太大的影響，且G 有延伸趨勢。這說明在達(dá)到最佳質(zhì)量濃度前，該藻的增長速率與營養(yǎng)鹽的質(zhì)量濃度正相關(guān)；超過最佳質(zhì)量濃度水平后，隨著營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度升高，增長速率將不再升高。從最大比增長速率來看，在NO3--N 質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時(shí)最大，32 mg·L-1時(shí)最小，但其增長速率較為平均，對(duì)數(shù)期較長，生長較旺盛，說明銅綠微囊藻在低濃度時(shí)瞬時(shí)增長速率較高，但是對(duì)數(shù)期后增長速率明顯減小，因此最佳NO3--N 質(zhì)量濃度為32 mg·L-1。PO43--P質(zhì)量濃度為0.02 mg·L-1和0.5 mg·L-1時(shí)最大比增長速率最大，而質(zhì)量濃度為5.4 mg·L-1時(shí)最小，且質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，其平均增長速率也較大。因此，銅綠微囊藻生長最佳PO43--P 質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1。

表 2 銅綠微囊藻在不同NO3--N 和PO43--P 質(zhì)量濃度下的生長情況Tab. 2 Growth of Microcystis aeruginosa underdifferent NO3--N and PO43--P concentrations

圖 2 不同磷質(zhì)量濃度下銅綠微囊藻生長狀況Fig. 2 Growth of Microcystis aeruginosa under different concentrations of phosphorus

雖然不同的浮游藻類在其生長過程中對(duì)營養(yǎng)鹽有各自不同的需求，但在多數(shù)湖泊中，浮游藻類的生長狀況與水體中營養(yǎng)鹽濃度變化的趨勢一致；受條件限制，不同實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果差異很大，一些研究證明水體中營養(yǎng)鹽的增加會(huì)導(dǎo)致其中附著藻類的生物量、生產(chǎn)力的顯著增加，而其他的則表明兩者之間的相關(guān)性不顯著。營養(yǎng)鹽濃度對(duì)熱帶藻類生長影響的研究［7］表明，氮、磷營養(yǎng)鹽濃度的增加對(duì)微囊藻的生長均有利，藻類的最大細(xì)胞產(chǎn)量均有明顯的增長；磷濃度的增加對(duì)三種菌株中MC 藻的暴發(fā)和生長具有明顯的促進(jìn)作用。飼料磷含量高低對(duì)水質(zhì)以及浮游生物組成的影響［8］探究結(jié)果顯示，高磷含量（13.5 g·kg-1和8.4 g·kg-1）主要會(huì)引發(fā)銅綠微囊藻的暴發(fā)，而低磷含量（8.7 g·kg-1和11.4 g·kg-1）則主要會(huì)引發(fā)食用藻類的暴發(fā)，這表明磷含量的高低在一定程度上會(huì)決定銅綠微囊藻的暴發(fā)。Baldia 等［9］研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻的最佳生長氮磷質(zhì)量濃度分別是8.71、0.22 mg·L-1；也有研究［10］表明，在BG11培養(yǎng)基中添加高濃度的氮(1 g·L-1NH4Cl)后，銅綠微囊藻的生長被顯著抑制(相關(guān)系數(shù)P ＜ 0.01)，但同時(shí)添加不同質(zhì)量濃度的磷(0.36～10 mg·L-1KH2PO4)顯著提高了銅綠微囊藻的生長(P ＜ 0.01)，不同磷質(zhì)量濃度處理之間無極顯著差異，氮磷平衡是影響銅綠微囊藻生長的重要因素。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，適合銅綠微囊藻生長的氮磷質(zhì)量濃度更高。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)和以上實(shí)驗(yàn)中營養(yǎng)元素的質(zhì)量濃度是有差異的。這種差異表明氮磷質(zhì)量濃度對(duì)藻類生長有共同的影響。有研究表明，水體中營養(yǎng)鹽狀態(tài)和浮游生物的光合作用活性之間存在著十分密切的相互作用［11］。由于葉綠素體是微藻進(jìn)行光合作用的場所，而氮又是組成葉綠體的主要元素，因此，氮的缺乏勢必會(huì)影響微藻的光合作用。由于磷元素參與多種物質(zhì)代謝過程中酶的合成，故可溶性蛋白和碳水化合物的合成可能會(huì)受磷所占比例的影響。

2.2 氮磷形態(tài)對(duì)銅綠微囊藻生長的影響

以上不同質(zhì)量濃度下NO3--N 和PO43--P 的研究可知，銅綠微囊藻生長的最佳氮質(zhì)量濃度為32 mg·L-1，磷質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1；在此質(zhì)量濃度下研究了NH4Cl、NaNO3、NaNO2三種氮源和K2HPO4、β-G-P、ATP 三種磷源對(duì)銅綠微囊藻生長的影響，分別測定藻樣中葉綠素a 質(zhì)量濃度及藻細(xì)胞密度，結(jié)果如圖2、3 所示。

圖3（a）表明，在實(shí)驗(yàn)的前6 天三種氮源對(duì)于藻細(xì)胞密度的增長貢獻(xiàn)極小，在第6 天后，均呈現(xiàn)出明顯的升高，特別是在第10 天后以N 和NO2--N 為氮源培養(yǎng)下的藻細(xì)胞密度均呈現(xiàn)快速增長的趨勢，但是NO3--N 氮源相對(duì)于N 氮源對(duì)于藻細(xì)胞密度的增長作用更為持久，并且較NO2--N 和NH4+-N 作為氮源對(duì)藻細(xì)胞密度的影響較大；而NH4+-N 對(duì)藻細(xì)胞密度的增長影響最為緩慢，后期藻密度僅為NO3--N 為氮源實(shí)驗(yàn)組的1/2。由圖3（b）中固定質(zhì)量濃度下氮源對(duì)于銅綠微囊藻葉綠素a 質(zhì)量濃度的影響可知，在實(shí)驗(yàn)的前6 天三種氮源形態(tài)對(duì)于葉綠素a 質(zhì)量濃度的變化一致；隨著時(shí)間的延長，葉綠素a 質(zhì)量濃度整體呈現(xiàn)增長趨勢，在前20 天，NO3--N較NO2--N 對(duì)銅綠微囊藻中葉綠素a 的增長趨勢較快，但在第20 天后，兩者呈現(xiàn)相反趨勢，表現(xiàn)為經(jīng)NO2--N 處理的藻體內(nèi)葉綠素a 質(zhì)量濃度與經(jīng)NO3--N 處理的相比要高，約為NH4+-N 實(shí)驗(yàn)組的2 倍；NH4+-N 處理的藻體內(nèi)葉綠素a 質(zhì)量濃度則一直以較為平緩的趨勢增長，且一直低于NO3--N 和NO2--N 處理的藻體內(nèi)葉綠素a 質(zhì)量濃度，最終達(dá)到的質(zhì)量濃度僅與NO3--N 和NO2--N 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)到第24 天的持平。由以上分析可知，適于銅綠微囊藻在氮質(zhì)量濃度為32 mg·L-1情況下生長的最佳氮源為NO3--N，依次為NO2--N 和NH4+-N。

圖 3 不同氮形態(tài)下銅綠微囊藻生長狀況Fig. 3 Growth of Microcystis aeruginosa under different nitrogen species

由圖4（a）中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)期的前12 天，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度增長趨勢相同且數(shù)值相近，第12 天后，三組均出現(xiàn)了明顯的波動(dòng)增長趨勢；ATP 實(shí)驗(yàn)組在第26 天處于優(yōu)勢增長狀態(tài)，但隨著K2HPO4實(shí)驗(yàn)組在第22 天后的快速增長，最終K2HPO4實(shí)驗(yàn)組在第26 天后藻細(xì)胞密度超過ATP 和β-G-P 實(shí)驗(yàn)組，占據(jù)了優(yōu)勢生長狀態(tài)；β-G-P 實(shí)驗(yàn)組在第22 天前的藻細(xì)胞密度高于K2HPO4實(shí)驗(yàn)組，隨著K2HPO4實(shí)驗(yàn)組在第22 天后的變化，在培養(yǎng)后期β-G-P實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度則一直低于ATP 和K2HPO4實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度。圖4（b）表現(xiàn)出三種磷源對(duì)培養(yǎng)的銅綠微囊藻產(chǎn)生的葉綠素a 質(zhì)量濃度均表現(xiàn)出一個(gè)波動(dòng)增長的過程，且三者的波動(dòng)增長周期相近；培養(yǎng)前期，K2HPO4和β-G-P 實(shí)驗(yàn)組較ATP 實(shí)驗(yàn)組中銅綠微囊藻對(duì)于培養(yǎng)基的適應(yīng)時(shí)間長，分別在第12 天、6 天和4 天后出現(xiàn)明顯的增長趨勢，且ATP 實(shí)驗(yàn)組對(duì)于藻內(nèi)葉綠素a 質(zhì)量濃度的增長一直處于優(yōu)勢狀態(tài)；在培養(yǎng)24 天后，各實(shí)驗(yàn)組中葉綠素a 質(zhì)量濃度表現(xiàn)出明顯差異，β-G-P 實(shí)驗(yàn)組較K2HPO4實(shí)驗(yàn)組在后期對(duì)于銅綠微囊藻體內(nèi)葉綠素a 的產(chǎn)生具有優(yōu)勢?？傮w而言，適于銅綠微囊藻在磷質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1下生長的最佳磷源為ATP，其次為K2HPO4和 β-G-P。

圖 4 不同磷形態(tài)下銅綠微囊藻生長狀況Fig. 4 Growth of Microcystis aeruginosa under different phosphorus species

氮磷是影響水體中浮游植物生長的重要限制因子，由于種屬及質(zhì)量濃度不同，藻類在對(duì)不同形態(tài)氮源和磷源的利用程度上也存在差異［12］。王正芳［13］在對(duì)藍(lán)藻生長的氮磷影響及控制機(jī)理研究中發(fā)現(xiàn)，水體中總氮、總磷含量并不能作為藻華發(fā)生及控制的判別依據(jù)，氮磷的存在形態(tài)也起著關(guān)鍵作用。氮磷的不同形態(tài)、不同質(zhì)量濃度均會(huì)對(duì)銅綠微囊藻的生長產(chǎn)生不同的影響，每種形態(tài)的營養(yǎng)鹽對(duì)銅綠微囊藻的最佳生長狀態(tài)的質(zhì)量濃度是有所區(qū)別的，適宜藻生長的最佳氮磷形態(tài)為NO3--N 和PO43--P。在對(duì)不同的氮鹽形態(tài)的研究中，多數(shù)研究都發(fā)現(xiàn)藻類會(huì)優(yōu)先利用NH4CI，當(dāng)水體中銨鹽質(zhì)量濃度高于硝酸鹽1～2 μmol·L-1時(shí)，銨鹽會(huì)抑制浮游植物對(duì)硝酸鹽的吸收，且細(xì)胞中的硝酸還原酶也會(huì)受到抑制［3,14］。也有學(xué)者認(rèn)為，微藻最容易利用的是銨態(tài)氮鹽，因?yàn)殇@鹽可以在谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的作用下，通過轉(zhuǎn)氨基作用迅速合成氨基酸，直接被微藻所利用［15］。關(guān)于浮游植物對(duì)亞硝酸鹽利用的研究一般會(huì)結(jié)合硝酸鹽被還原的過程，因?yàn)樵谖⒃逦绽孟跛猁}時(shí)會(huì)進(jìn)行一系列轉(zhuǎn)化：硝酸鹽—亞硝酸鹽，亞硝酸鹽—銨鹽，在此過程中微藻會(huì)釋放一定量的亞硝酸鹽。陳衛(wèi)民［16］在研究亞硝酸鹽對(duì)銅綠微囊藻生理特性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在亞硝酸鹽單獨(dú)存在的條件下，質(zhì)量濃度小于5 mg·L-1的亞硝酸鹽對(duì)銅綠微囊藻的生長沒有明顯影響，隨著培養(yǎng)基中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度逐漸升高到20 mg·L-1，亞硝酸鹽通過抑制銅綠微囊藻的光合作用和升高藻體內(nèi)氧自由基質(zhì)量濃度的方式抑制藻的生長。對(duì)伊利湖的莫米、桑達(dá)斯基海灣以及圣大瑪麗湖［17］中藻類水華的暴發(fā)與氮源關(guān)系的研究表明，銨離子質(zhì)量濃度對(duì)藍(lán)藻水華的暴發(fā)影響最大，藍(lán)藻的生長速率最快；其次為尿素、氨基酸和丙氨酸對(duì)藍(lán)藻暴發(fā)的影響；硝酸鹽的影響則最弱，藍(lán)藻增長速率最低；后期通過穩(wěn)定同位素15N 的培養(yǎng)研究同樣表明，藍(lán)藻在其他氮離子存在的情況下，對(duì)于銨離子的吸收利用率最高。

在硝酸鹽存在的條件下硝酸鹽能夠抑制藻對(duì)亞硝酸鹽的吸收，并且亞硝酸鹽還會(huì)被氧化為硝酸鹽，表明此條件下可以誘導(dǎo)銅綠微囊藻生成亞硝酸氧化還原酶。亞硝酸鹽的吸收實(shí)驗(yàn)顯示在銨鹽存在的條件下，藻對(duì)亞硝酸鹽吸收的半飽和常數(shù)減少，表明銨鹽能夠刺激藻對(duì)亞硝酸鹽的吸收，增加藻細(xì)胞內(nèi)的亞硝酸鹽含量。也有學(xué)者認(rèn)為微藻細(xì)胞對(duì)硝酸鹽的吸收能力要大于銨鹽，因?yàn)樵谙跛猁}存在條件下微藻能更好地合成蛋白質(zhì)。肖華山等以(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、KNO3、尿素分別作為氮源培養(yǎng)紫球藻(Porphyridium cruentum)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaNO3和KNO3作為氮源有利于微藻合成蛋白質(zhì)，而銨鹽則不利于蛋白質(zhì)的合成，并且NaNO3和KNO3缺乏時(shí)，細(xì)胞會(huì)停止蛋白質(zhì)的合成。此外，王素琴等［18］的研究表明，在正常的培養(yǎng)條件下，與尿素和氯化銨相比，硝酸鉀是促進(jìn)小球藻(Chlorella)生物合成葉黃素的最佳氮源，小球藻細(xì)胞中的葉黃素含量可以達(dá)到0.85 mg·g-1。

關(guān)于藻類對(duì)有機(jī)磷的利用可能有兩條途徑：一是直接吸收利用，主要是對(duì)于小分子的有機(jī)磷；二是對(duì)于較大分子有機(jī)磷，則需經(jīng)過如堿性磷酸酶等水解后吸收利用。在對(duì)不同磷鹽形態(tài)的相關(guān)研究中已有實(shí)驗(yàn)表明，微小亞歷山大藻(Alexandrium minutum)、銅綠微囊藻、湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangenis)和小球藻等可以利用磷酸葡萄糖、磷酸甘油和ATP 等作為磷鹽的來源［19-20］，這說明許多浮游植物都能利用有機(jī)磷化合物作為營養(yǎng)物質(zhì)來源。李英等［21］研究東海原甲藻對(duì)不同磷源的利用特征時(shí)提出東海原甲藻對(duì)ATP 和G-6-P 可能是直接吸收，而對(duì)G-P可能是第二條利用途徑。除了胞外的磷酸鹽對(duì)藻體生長有影響外，胞內(nèi)磷酸鹽也是影響藻生長的主要因子［22］。

本研究表明，銅綠微囊藻在不同形態(tài)的氮磷營養(yǎng)鹽下均能夠持續(xù)增長，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度不斷下降，但是銅綠微囊藻一直呈增長趨勢，說明藻類在適應(yīng)期后，體內(nèi)積聚的營養(yǎng)物質(zhì)有助于藻在后期的持續(xù)增長；對(duì)于不同形態(tài)營養(yǎng)鹽所選取的培養(yǎng)期的質(zhì)量濃度相同，這也從一方面表現(xiàn)出研究的局限性，即藻類由于在不同形態(tài)營養(yǎng)鹽下生長所需的最佳質(zhì)量濃度存在差異，因此也會(huì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的影響；此外，由于不同藻類對(duì)于生長所需的最佳營養(yǎng)鹽形態(tài)以及營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度等存在差異，因此銅綠微囊藻的生長所需的營養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度和最佳營養(yǎng)鹽形態(tài)與其他藻類不同。

3 結(jié) 論

通過對(duì)氮、磷質(zhì)量濃度與形態(tài)的研究可以發(fā)現(xiàn)：

（1）綠微囊藻在不同質(zhì)量濃度NO3--N 培養(yǎng)下生長的最佳質(zhì) 量濃度為32 mg·L-1；在質(zhì)量濃度為32 mg·L-1下，NO3--N、NH4+-N 和NO2--N三種氮鹽中，對(duì)于銅綠微囊藻生長最佳氮源為NO3--N，其次為NO2--N 和NH4+-N。

（2）綠微囊藻在不同K2HPO4質(zhì)量濃度下生長的最佳質(zhì) 量濃度為0.5 mg·L-1；在質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1下，ATP、K2HPO4和 β-G-P 三種磷源中，對(duì)于銅綠微囊藻生長最佳磷源為ATP，其次為K2HPO4和 β-G-P。