秦 凱，陳芳清，張 行，黃永文，劉楊赟

（1.湖北省三峽地區(qū)生態(tài)保護與治理國際聯(lián)合研究中心，湖北 宜昌 443002；2.湖北正江環(huán)保科技有限公司，湖北 宜昌 443002)

0 引言

我國是農(nóng)業(yè)大國，擁有豐富的農(nóng)作物秸稈資源，僅2017年我國秸稈的理論資源總量就已達10.2億t[1]。農(nóng)作物秸稈作為重要的生物資源，具有多種用途，但由于我國農(nóng)村燃料結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，秸稈轉(zhuǎn)化技術(shù)尚不成熟等原因，其利用率較低，多被遺棄或焚燒，不僅造成了資源浪費還引發(fā)了諸多環(huán)境問題[2-3]。在化石能源逐漸枯竭，能源緊張的背景下，農(nóng)作物秸稈作為一種富含有機質(zhì)（80%～90%）的生物質(zhì)已成為一種重要的新能源[4]。厭氧發(fā)酵技術(shù)既能實現(xiàn)秸稈的資源化利用，又能生產(chǎn)清潔的生物能源，是實現(xiàn)農(nóng)作物秸稈資源化利用的有效途徑之一，國內(nèi)外學者對此展開了廣泛研究[5]。秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷的方式可分為設施發(fā)酵（發(fā)酵罐和沼氣池）和田間實地發(fā)酵[6-7]。田間實地發(fā)酵產(chǎn)甲烷技術(shù)是利用特制的膜系統(tǒng)覆蓋，再通過水淹基部土壤在田間營造無氧環(huán)境，將秸稈和土壤混合后進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷，最后通過收集系統(tǒng)將氣體收集起來加以利用。該技術(shù)既能把秸稈轉(zhuǎn)化為清潔能源，改善土壤結(jié)構(gòu)，又避免了傳統(tǒng)發(fā)酵工程中存在的運輸難、成本高等問題，且經(jīng)過國產(chǎn)化生產(chǎn)，其設施成本已降低了87.75%，既具生態(tài)效益又具有經(jīng)濟效益，具有良好的應用前景[8]。

在秸稈厭氧發(fā)酵過程中，不同的接種物因含有不同的菌群，會直接影響厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的進程和效率。加入充足、優(yōu)質(zhì)的厭氧活性微生物作為接種物可以提高秸稈厭氧發(fā)酵的降解速率和生物甲烷產(chǎn)量，縮短啟動時間等[9]。因此，對高效接種物篩選及其作用機理研究一直是該領域的研究熱點[10]。如GU 等[11]評估了牛糞沼液、豬糞沼液、雞糞沼液3 種沼液和市政消化污泥、消化顆粒污泥和造紙廠污泥3 種污泥用作接種物和稻稈進行厭氧發(fā)酵的效果，發(fā)現(xiàn)沼液比污泥更適合作接種物。目前，田間實地厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷技術(shù)的研究僅限于以稻田土壤中的微生物作為接種物來源，存在接種物單一、產(chǎn)氣效率低下等問題[7]，尚未開展有關(guān)接種物的深入研究。為此，本研究開展了不同接種物對模擬水稻秸稈田間厭氧發(fā)酵系統(tǒng)甲烷生產(chǎn)和秸稈降解作用的研究。本研究根據(jù)田間實地發(fā)酵產(chǎn)甲烷技術(shù)研發(fā)的需求，在實驗室內(nèi)控制溫度的條件下，模擬田間實地厭氧發(fā)酵系統(tǒng)，通過添加不同液體接種物，測定各處理累積產(chǎn)氣量、甲烷含量和秸稈降解率的變化，揭示接種物對田間實地厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷及秸稈降解的影響，為秸稈田間實地厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷技術(shù)在我國的推廣與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置與材料

1.1.1 試驗裝置

本試驗在模擬田間實地厭氧發(fā)酵原理的發(fā)酵裝置內(nèi)進行，該裝置包括有效容積分別為2 L 的發(fā)酵瓶和550 mL 的集氣瓶。其中發(fā)酵瓶用于混裝秸稈、土壤浸出液和接種物，用瓶蓋密封以營造發(fā)酵無氧環(huán)境。發(fā)酵瓶瓶蓋上鉆出2 孔，分別作為取樣孔和集氣孔，用硅膠管連接集氣孔與集氣瓶收集產(chǎn)氣。取樣孔平日用止水夾封閉。

1.1.2 發(fā)酵原料與接種物

試驗所用水稻秸稈取自湖北省枝江農(nóng)科院水稻田，取回后經(jīng)自然風干，切碎至3～5 cm 小段，測得總有機碳（TOC）質(zhì)量分數(shù)為431.39 g/kg，總氮（TN）質(zhì)量分數(shù)為8.22 g/kg，含水率為6.01%。經(jīng)尿素溶液氨化預處理（使發(fā)酵底物碳氮比約為20 ∶1）5 d 后備用。為模擬田間發(fā)酵系統(tǒng)水淹特點及避免土壤吸附能力對試驗結(jié)果造成影響，以土壤浸出液的方式添加土壤微生物，土壤取自于湖北枝江農(nóng)科院長期種植水稻的稻田，取回后參照楊軍等[12]的方法，以1 kg 土壤添加1 L 去離子水浸泡，攪拌均勻，待充分浸出后，靜置過濾，留取清液備用。試驗所用的接種物為沼液和豬糞浸出液，沼液和豬糞取自湖北枝江農(nóng)科院沼氣池和養(yǎng)殖場。豬糞取回后參照楊軍等[12]的方法進行豬糞浸出液的制取，以1 kg 新鮮豬糞添加1 L 去離子水浸泡，攪拌均勻，靜置過濾。接種物均濾去殘渣，留其清液備用。試驗材料的特性見表1。

表1 發(fā)酵原料與接種物的特性

1.2 試驗設計

試驗以接種物種類為試驗因子，接種物處理包括500 mL 的沼液和豬糞浸出液、以及500 mL 體積比為1 ∶1 的沼液+ 豬糞浸出液混合液，分別標記為A，B，C。另外還設置添加等體積500 mL 去離子水的對照組，標記為CK。每個處理水平均設置3 個重復，共計12 組試驗。以經(jīng)氨化預處理5 d 后的水稻秸稈為原料，干物質(zhì)質(zhì)量均為80 g，添加500 mL 稻田土壤浸出液作為環(huán)境基質(zhì)，然后分別添加上述接種物，混勻后密封置于30±1 ℃恒溫氣候箱內(nèi)進行厭氧發(fā)酵試驗。根據(jù)湖北地區(qū)一般于4月中下旬到9月中下旬大面積種植中稻的特點，農(nóng)閑期較長，整個發(fā)酵試驗為期90 d，試驗期間每日觀察產(chǎn)氣情況，并記錄相關(guān)參數(shù)。

1.3 測定指標與方法

在試驗前分別測定了發(fā)酵原料的TOC，TN，TS和原料揮發(fā)性固體（VS）。其中TOC 用K2Cr2O7-外熱源法測定，TN 采用全自動凱氏定氮儀測定，TS 的測定用干燥恒重法，VS 的測定用灼燒恒重法。厭氧發(fā)酵期間每5 d 對各處理的產(chǎn)氣量和甲烷含量進行測定，產(chǎn)氣量測定方法為排水法，甲烷含量測定用氣相色譜法，同時吸取少量發(fā)酵液利用比色法測定其揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）質(zhì)量濃度。并在氨化預處理前后和整體試驗后分別從各處理取秸稈樣品測定其纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量，測定方法分別為72%濃硫酸水解法、2 mol/L 鹽酸水解法和濃硫酸法。秸稈木質(zhì)纖維素降解率和總降解率的計算公式如下：

式中：Rh為秸稈木質(zhì)纖維素降解率，%；S0為處理前木質(zhì)纖維素質(zhì)量分數(shù)，%；Se處理后木質(zhì)纖維素質(zhì)量分數(shù)，%；Rd為秸稈總降解率，%；m0為處理前秸稈干物質(zhì)質(zhì)量，g；me為處理后秸稈干物質(zhì)質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與初步分析，以平均值繪制曲線圖，分析不同接種物厭氧發(fā)酵進程中甲烷產(chǎn)氣量、甲烷含量、pH 值、VFAs 質(zhì)量濃度的動態(tài)變化；以接種物種類為變量，以90 d 發(fā)酵試驗的累積產(chǎn)氣量、TS 產(chǎn)氣率和秸稈木質(zhì)纖維素含量為因變量，采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析，分析接種物種類對厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣和秸稈降解的影響，當單因子作用效果影響達到顯著水平時（p＜0.05），采用S-N-K 法進行多重比較，分析各處理之間的差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種物對水稻秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷進程的影響

各試驗組甲烷產(chǎn)氣量、甲烷含量、VFAs 質(zhì)量濃度和pH 值隨時間變化均呈大致相同的變化趨勢見圖1。由圖1 可知，甲烷產(chǎn)氣量呈下降-上升-下降的變化，甲烷含量呈上升-下降的變化，pH 值則呈下降-上升的變化，而VFAs 呈上升-下降的變化。接種物種類對水稻秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷進程有一定影響。因接種物厭氧發(fā)酵菌群的不同，各處理相關(guān)參數(shù)峰值出現(xiàn)的時間、峰值的大小均有差異。圖1（a）中甲烷產(chǎn)氣量方面，對照值（CK）處理在第25 天才開始產(chǎn)氣，其余處理在第5 天即開始產(chǎn)氣，但經(jīng)歷了10～25 d 的產(chǎn)氣停滯期。隨后各處理進入產(chǎn)氣高峰期，峰值出現(xiàn)在第35～55 d 之間。在甲烷產(chǎn)氣量方面以A 處理的峰值最高（336.78 mL），以CK 處理的峰值最低（115.04 mL），前者比后者高192.75%；圖1（b）中甲烷含量方面，以A 處理的峰值最高（69.62%），以CK 處理的峰值最低（53.17%），前者比后者高30.94%。

圖1 不同接種物對厭氧發(fā)酵的影響

圖1（c）中VFAs 質(zhì)量濃度方面，各處理在厭氧發(fā)酵第10 d 時有一個高峰，隨后A 和B 處理VFAs質(zhì)量濃度開始下降，而C 和CK 處理則繼續(xù)上升。以C 處理的峰值最高（4.33 g/L），以CK 處理的峰值最低（3.18 g/L），前者比后者高36.16%；圖1（d）中pH值方面，不同試驗組pH 值的變化范圍有較大差異，A 和B 處理pH 值變化范圍較小，分別在6.38～7.48和6.22～7.47；C處理的pH值變化范圍在5.82～7.39；CK 處理的pH 值變化范圍最大，在5.43～7.18。

2.2 接種物種類對水稻秸稈厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣率的影響

接種物種類對水稻秸稈厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率存在的顯著影響（p ＜0.05）見圖2。由圖2可知A 和B 處理對水稻秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣具有促進作用，相比于CK，A 處理累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率提高了70.82%，B 處理累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率提高了42.66%。C 處理對累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率均無顯著影響（p ＞0.05），累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率相比CK 組僅提高了4.28%。

圖2 不同接種物對厭氧發(fā)酵累積產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣率的影響

2.3 接種物種類對水稻秸稈降解的影響

接種物種類對水稻秸稈的木質(zhì)纖維素含量和干物質(zhì)質(zhì)量的顯著影響（p ＜0.05）見表2。經(jīng)厭氧發(fā)酵后，秸稈纖維素和半纖維素被厭氧微生物大量分解，其含量大幅降低，而木質(zhì)素因難以降解其含量反而升高。A，B，C 各處理纖維素降解率分別為42.20%，39.39%和32.06%，而CK 僅為21.46%；A，B，C 各處理半纖維素降解率分別為42.70%，34.78%和40.61%，CK 僅為30.04%；A，B，C 各處理秸稈總降解率分別為54.71%，54.29%和41.79%，CK 僅為30.30%。各處理中以A 處理的纖維素降解率、半纖維素降解率和總降解率均最高，相比CK 組分別提高了96.64%，42.14%和80.56%。

表2 添加不同接種物對厭氧發(fā)酵秸稈成分的影響

3 討論

3.1 接種物種類對厭氧發(fā)酵進程的影響

厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷是一個復雜的進程，包括水解酸化、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷等3 個階段[13]。在水解酸化階段，先由水解菌將木質(zhì)纖維素等復雜聚合物水解為單一或較復雜的化合物，再由酸化菌將其分解為單糖、氨基酸、脂肪酸等產(chǎn)物。在產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段，產(chǎn)酸菌進一步將各種脂肪酸降解為乙酸、二氧化碳和氫氣。在產(chǎn)甲烷階段，產(chǎn)甲烷菌主要利用乙酸、氫氣、二氧化碳等簡單的物質(zhì)生產(chǎn)甲烷以及合成自身的細胞物質(zhì)。以上3 個階段非產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)甲烷菌間通過協(xié)同作用、拮抗作用共同維系厭氧發(fā)酵微生物群落的穩(wěn)定性，任何階段微生物種類和數(shù)量發(fā)生變化，都會對厭氧發(fā)酵進程產(chǎn)生影響[14]。

本試驗中，添加接種物后，各處理對產(chǎn)氣量和產(chǎn)甲烷含量的變化趨勢沒有改變，但是各處理產(chǎn)甲烷啟動時間、停滯期、峰值出現(xiàn)的時間、峰值的大小均有較大變化，其同期的pH 值和VFAs 質(zhì)量濃度也發(fā)生相應的變化。出現(xiàn)差異的原因是不同接種物所含有的微生物類群的差異所導致的[15]。添加單一沼液和豬糞浸出液的處理，接種物均含有由產(chǎn)甲烷菌和非產(chǎn)甲烷菌組成的厭氧發(fā)酵菌群，如能夠降解有機物的厚壁菌門，能利用所有產(chǎn)甲烷途徑的甲烷八疊球菌屬等，但其優(yōu)勢菌群的差異導致發(fā)酵進程有所差異。接種物的添加不僅能改善厭氧發(fā)酵微生物菌群結(jié)構(gòu)，還能抑制脂肪酸的累積，有利于快速啟動厭氧發(fā)酵和提高甲烷產(chǎn)量[16]，因此其厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷啟動速度、產(chǎn)甲烷峰值和甲烷含量均顯著高于對照。添加混合接種物的處理，雖然在啟動速度、產(chǎn)甲烷峰值方面均高于對照，但在緩解酸累積方面卻低于對照。其原因可能是混合接種物使微生物群落失去平衡，接種物和發(fā)酵基質(zhì)中的酸解菌種類和數(shù)量較多，產(chǎn)甲烷菌的種類和數(shù)量較少，發(fā)酵基質(zhì)分解較快，產(chǎn)生酸累積。由于產(chǎn)甲烷菌最適pH 值在6.8～7.2，酸累積導致產(chǎn)酸菌活性高于產(chǎn)甲烷菌，VFAs 過量累積。

3.2 接種物種類對秸稈降解和甲烷生產(chǎn)的影響

秸稈中主要的化學成分是木質(zhì)纖維素，纖維素和半纖維素被疏水的木質(zhì)素層緊密包裹,且木質(zhì)素最難以被微生物降解利用，因此秸稈的水解是厭氧發(fā)酵的限速步驟，影響秸稈的轉(zhuǎn)化效率[17]。秸稈厭氧發(fā)酵降解和產(chǎn)甲烷的過程是一個產(chǎn)甲烷菌和非產(chǎn)甲烷菌相互作用，相互制約的過程：①在厭氧發(fā)酵中，厚壁菌門夠降解復雜有機物，擬桿菌門和變形菌門則是水解和產(chǎn)酸的主要菌群[18]，這些水解菌和酸化菌等微生物促進秸稈降解為單糖、氨基酸、脂肪酸等產(chǎn)物。秸稈的降解本身受水解菌和酸化菌的影響，提高水解菌和酸化菌的數(shù)量與活性能促進秸稈的分解；②秸稈降解可為產(chǎn)甲烷菌提供可供利用的小分子和眾多副產(chǎn)物，如VFAs，NH4+，H2S 等，若小分子和眾多副產(chǎn)物能及時被產(chǎn)甲烷菌利用形成甲烷，則秸稈的降解和甲烷的生產(chǎn)都會順利進行。但是當小分子和眾多副產(chǎn)物不能被產(chǎn)甲烷菌利用形成甲烷，則會導致中間產(chǎn)物的累積，抑制水解菌和酸化菌的生長與活性，從而影響對秸稈的分解與利用。

已有的研究表明，混合微生物菌群間的協(xié)同作用能更好地促進生物質(zhì)固體廢物的厭氧消化，是提高生物質(zhì)固體廢物可降解性的有效途徑。本試驗中添加接種物的各處理纖維素、半纖維素的降解率和總降解率均顯著高于對照組，其中以添加沼液和豬糞浸出液對秸稈的降解效果最好。接種物的添加還能提高累積產(chǎn)氣量，其中也以添加沼液和豬糞浸出液的單一接種物處理最為顯著，其TS 產(chǎn)氣率也顯著高于對照組。其原因是接種物中所含有的水解菌、酸化菌和產(chǎn)甲烷菌構(gòu)成了穩(wěn)定的厭氧發(fā)酵菌群，使秸稈得到更徹底的分解[16]?；旌辖臃N物對秸稈的降解效果和累積產(chǎn)氣量雖高于對照組，但卻低于單一接種物處理，其原因可能是混合接種物的微生物菌群不具有互補性，并存在拮抗作用。這種作用使得非產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)甲烷菌處于不穩(wěn)定的非平衡狀態(tài)，產(chǎn)甲烷菌的作用受到影響，最終影響秸稈的降解和甲烷的生產(chǎn)效率。本實驗中，各處理所含微生物種類的具體差異及其效應將另外成文進一步分析。

4 結(jié)論

（1）添加接種物對厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷的變化趨勢沒有影響，但可縮短產(chǎn)氣停滯期，緩解厭氧發(fā)酵前期的酸化，促進甲烷產(chǎn)氣峰值提前出現(xiàn)和提高峰值。其中以添加沼液的試驗組最先恢復產(chǎn)氣，甲烷產(chǎn)氣峰值出現(xiàn)在第45 天，為336.78 mL，相比對照組提高了192.75%。

（2）添加接種物可有效促進秸稈降解，各處理的纖維素、半纖維素降解率和總降解率均顯著高于對照組。其中添加沼液的試驗組纖維素、半纖維素降解率分別比對照提高96.64%和42.14%，總降解率則提高80.56%。

（3）添加接種物可有效提高秸稈厭氧發(fā)酵的累積產(chǎn)氣量和TS 產(chǎn)氣率。其中添加沼液的試驗組累積產(chǎn)氣量最高為4 458.33 ±99.85 mL，TS 產(chǎn)氣率最高為59.29±1.33 mL/g，相比對照組提高了70.82%。