伍 晴，羅銀河△，王孟清，陳瑩瑩，馬曉萌，胡 燕

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）的免疫學(xué)機(jī)制是Th1/Th2 細(xì)胞功能失衡，Th2 免疫應(yīng)答優(yōu)勢(shì)，刺激其他細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)，最終誘發(fā)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和慢性氣道炎癥［1］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起小兒呼吸道黏膜感染的常見(jiàn)病原體，與哮喘的發(fā)病存在明顯關(guān)系。RSV 是單鏈RNA 病毒，其中所含的F 蛋白主要引起Th1 型炎癥反應(yīng)，G 蛋白主要引起Th2 型炎癥反應(yīng)，因此RSV感染可以導(dǎo)致以上2種炎癥反應(yīng)的失衡，可能是引起哮喘的因素［2］。腦信號(hào)蛋白4D（semxpahorin 4D，Sema4D）在慢性病毒持續(xù)感染中發(fā)揮重要作用，但是否參與RSV所致哮喘大鼠Th1/Th2的免疫調(diào)節(jié)，尚待研究［3］。

本研究通過(guò)RSV 復(fù)合卵清蛋白（ovalbumin，OVA）構(gòu)建哮喘大鼠模型，觀察Sema4D 對(duì)RSV 所致哮喘大鼠Th1/Th2 的免疫調(diào)節(jié)及咳喘寧（Kechuan?ning，KCN）灌胃處理對(duì)哮喘大鼠肺組織病理改變和支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中相關(guān)炎癥因子的影響，為闡明咳喘寧通過(guò)調(diào)節(jié)Sema4D 減輕RSV 所致哮喘氣道免疫炎癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性Wistar大鼠100只，90～110 g，28～35日齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006。

1.2 藥物與試劑 咳喘寧口服液（主要由炙麻黃、苦杏仁、細(xì)茶葉、桃仁、大青葉、生石膏、黃芪、甘草等組成）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供［（湘）衛(wèi)藥劑（06）05第085號(hào)］，每瓶100 mL，含生藥70 g。按臨床量效關(guān)系確定咳喘寧口服液低、中、高劑量分別為0.33、3和10 mL/kg。RSV 和人喉癌上皮Hep-2 細(xì)胞（武漢大學(xué)病毒研究所）。雞OVA（Solarbio）；Sema4D 重組蛋白（Sino Biological，生產(chǎn)批號(hào)80320-R08H）；抗Sema4D 抗體（Bioss，生產(chǎn)批號(hào)bs-6965R）；白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的ELISA 試劑盒（上海晶天生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠RSV 復(fù)合OVA 哮喘模型的制備 將大鼠隨機(jī)分為正常（normal）組（10 只）和哮喘模型組（90只）。參照文獻(xiàn)建立急性哮喘大鼠模型［4-6］，以滴度為1.0×109空斑形成單位（plaque-forming unit，PFU）/L的 RSV 50 μL 鼻腔滴入，第 2 天相同劑量加強(qiáng) 1 次，第 2～7 天正常飼養(yǎng)，從第 7 天開(kāi)始給予 1%OVA 隔天霧化吸入，每次30 min，持續(xù)2 周；正常組在相同時(shí)間、相同劑量下予Hep-2 細(xì)胞滴鼻吸入及生理鹽水霧化。造模結(jié)束后選取6 只模型組大鼠進(jìn)行氣道反應(yīng)性檢測(cè)，大鼠氣道反應(yīng)性升高并出現(xiàn)噴嚏、鼻腔分泌物增多、呼吸加快等行為學(xué)表現(xiàn)提示造模成功。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 將造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為9 組，每組6 只，包括：模型（model）組；Sema4D 組（0.01 mg/kg Sema4D 重組蛋白腹腔注射）；Sema4D 抗體組（0.01 mg/kg Sema4D 抗體腹腔注射）；咳喘寧低、中、高劑量組（以低、中、高劑量的咳喘寧口服液灌胃）；Sema4D+咳喘寧低、中、高劑量組（以Sema4D 腹腔注射及低、中、高劑量的咳喘寧口服液灌胃）。正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，共2周。

2.3 標(biāo)本采集

2.3.1 BALF 采集 對(duì)經(jīng)方法2.2 治療2 周后的所有大鼠進(jìn)行胸腔麻醉后用細(xì)線綁好四肢及頭部，固定在無(wú)菌鼠板上，用手術(shù)剪逐層剪開(kāi)大鼠胸頸部皮膚和筋膜，分離頸部血管，一側(cè)氣管結(jié)扎，注入0.5 mL PBS 進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，反復(fù)3 次，收集BALF（回收率＞80%為合格），4℃離心15 min，取上清液于-80℃冰箱保存。

2.3.2 肺臟標(biāo)本處理 完整分離出大鼠兩側(cè)肺臟，一側(cè)于4%多聚甲醛浸泡固定，另一側(cè)于-20℃冷凍保存。

2.4 肺組織學(xué)檢查 將經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定的肺組織，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、脫蠟和水化，然后進(jìn)行HE 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理學(xué)變化。

2.5 BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 含量的檢測(cè) 根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書的步驟，依次檢測(cè) BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 的含量。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠支氣管黏膜上皮無(wú)變形，肺泡及血管形態(tài)規(guī)整，無(wú)細(xì)胞脫落，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)；模型組、Sema4D 組及Sema4D+咳喘寧低劑量組大鼠支氣管及血管周圍可見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁各層可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎性團(tuán)塊聚集，肺泡形態(tài)不規(guī)整，含大量杯狀細(xì)胞，黏膜上皮局部脫落，黏膜下水腫；Sema4D抗體組、咳喘寧低、中、高劑量組及Sema4D+咳喘寧中、高劑量組上述病理變化均較模型組明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡形態(tài)較為規(guī)整，見(jiàn)圖1。

Figure 1.HE staining of lung tissues of the rats in different groups（scale bar=100 μm）.A：normal group；B：model group；C：Sema4D group；D：Sema4D antibody group；E：low dose of KCN group；F：middle dose of KCN group；G：high dose of KCN group；H：Sema4D+low dose of KCN group；I：Sema4D+middle dose of KCN group；J：Sema4D+high dose of KCN group.圖1 各組大鼠肺組織HE染色

2 BALF中各種炎癥因子含量的比較

ELISA 結(jié)果顯示，與正常組相比，其余各組BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的含量都有不同程度的升高，IFN-γ 顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組相比，Sema4D 組 IL-4、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的含量顯著升高，IFN-γ 的含量降低（P＜0.05 或P＜0.01），Sema4D 抗體組，咳喘寧低、中、高劑量組，以及Sema4D+咳喘寧中、高劑量組的IL-4、IL-6、IL-8 和TNF-α 含量均顯著降低（P＜0.01），IFN-γ 顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），而Sema4D+咳喘寧低劑量組上述指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與咳喘寧低、中、高劑量組相比，Sema4D 抗體組及Sema4D+咳喘寧中、高劑量組上述指標(biāo)均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2.Comparison of the levels of inflammatory factors in BALF of the rats in different groups.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.圖2 各組大鼠BALF中炎癥因子含量的比較

討 論

RSV 感染可引起Th1 和Th2 兩大功能亞群的炎癥反應(yīng)，Th1 細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，即殺滅病毒和其他胞內(nèi)病原體，其產(chǎn)生的IFN-γ可以抑制炎癥因子IL-4 的水平，IL-4 過(guò)高會(huì)促進(jìn)免疫球蛋白E 的生成，誘發(fā)機(jī)體反復(fù)喘息，因此通過(guò)IFN-γ抑制IL-4可以避免患兒進(jìn)一步發(fā)展成哮喘［7-8］；Th2 細(xì)胞介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)，其產(chǎn)生的IL-4和IL-6促進(jìn)了IgE 的合成及嗜酸性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)的聚集、活化和釋放細(xì)胞因子，可引起哮喘的慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性，刺激成纖維細(xì)胞增生及杯狀細(xì)胞分化，參與氣道重建［9］。RSV感染后，呼吸道單核吞噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等產(chǎn)生的IL-8 和TNF-α，可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集并破壞上皮/內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，參與炎癥反應(yīng)及氣道重塑［10］。IL-8 和TNF-α 在RSV 感染誘發(fā)哮喘的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用［11-12］。

Sema4D 在免疫炎癥發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用［13］，且Sema4D是Th2驅(qū)動(dòng)型哮喘病理生理過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，Sema4D缺失可能會(huì)抑制肺部Th2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生［14-15］。本研究結(jié)果證實(shí)，Sema4D 可使哮喘大鼠BALF中IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α水平升高，IFN-γ含量降低，引起Th1/Th2 失衡，加重哮喘癥狀；Sema4D抗體組的炎癥因子濃度與正常組無(wú)顯著差異，說(shuō)明通過(guò)干預(yù)Sema4D 可以減少炎癥因子的產(chǎn)生，糾正Th1/Th2失衡。

咳喘寧口服液以傳統(tǒng)古方五虎湯為基本方研制而成，具有發(fā)表清熱、化痰和平喘的功效，在臨床上用以防治病毒感染引起的哮喘，療效肯定，且與Th亞群調(diào)節(jié)作用相關(guān)［16］。本研究結(jié)果表明，咳喘寧對(duì)RSV 所致哮喘有效，且Sema4D 聯(lián)合咳喘寧中、高劑量組BALF 中炎癥因子濃度與咳喘寧各劑量組相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明咳喘寧可能通過(guò)干預(yù)Sema4D，調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，減輕免疫炎癥，以達(dá)到治療效果。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，咳喘寧可能通過(guò)干預(yù)Sema4D，調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫失衡，減少炎癥因子產(chǎn)生，從而抑制RSV所致哮喘大鼠的免疫炎癥。