郭義威，孫春莉，王樹興

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453003）

纖維化的病理特征主要為斑塊狀慢性間質(zhì)炎癥，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積，成纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致病變組織進(jìn)行性纖維化和功能的喪失。盡管在實(shí)驗(yàn)和臨床方面對纖維化進(jìn)行了廣泛研究，但仍缺乏有效的治療方法［1-2］。因此探索并闡明纖維化疾病的機(jī)制尤為重要。

轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）被公認(rèn)為是主要的致纖維化細(xì)胞因子，在肺組織中TGF-β1 主要分布于支氣管上皮細(xì)胞、增生的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中［3］。TGF-β1可以調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT），從而誘導(dǎo)多種纖維化細(xì)胞分化成纖維母細(xì)胞［4］。同時(shí)大量研究發(fā)現(xiàn)，在肺纖維化中TGF-β1/SMADs 信號通路異常表達(dá)可引起膠原沉積、成纖維細(xì)胞趨化、EMT等［5］。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）作為一種非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥損傷、組織發(fā)育及修復(fù)過程中發(fā)揮著十分重要的作用，這些廣泛的生物學(xué)作用使其成為疾病治療的新靶點(diǎn)及診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。雖然當(dāng)前已有報(bào)道表明多種 miRNA 在纖維化中發(fā)揮了重要作用［6-7］，然而，miRNA 如何調(diào)控肺纖維化（尤其是矽肺），目前仍未知。本研究旨在觀察miR-433 在纖維化中發(fā)揮的作用，分析miR-433 對矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的影響，并進(jìn)一步研究miR-433 在TGF-β1 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞纖維化中的作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑

選取 6～8 周齡 C57BL/6 健康雄性小鼠 18 只，體重19～24 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK（豫）2017-0001，清潔環(huán)境喂養(yǎng)。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3 購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。青-鏈霉素溶液和胎牛血清均購于Ther?mo Fisher Scientific；miR-433 和內(nèi)參照 U6 的引物購自 QIAGEN；TGF-β1 購自 PeproTech；Trizol 試劑購自Invitrogen；HE 染色試劑盒和Masson 染色試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所；雙螢光素酶檢測試劑盒和抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體購自Abcam；DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa；抗SMAD2、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和 p-SMAD2 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔Ⅱ抗均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NIH-3T3細(xì)胞在添加100 mg/L青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將NIH-3T3 細(xì)胞按照Lipofectami?neTM2000 試劑制造商規(guī)定的步驟分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-433 mimic。轉(zhuǎn)染48 h后，用含2 μg/L TGF-β1的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h。

2.3 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 利用TargetScan（http：//www.targetscan.org）預(yù)測 SMAD2 的 3'-UTR可能與miR-433 存在相結(jié)合的位點(diǎn)。SMAD2 野生型3'-UTR 螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-SMAD2-wt 和突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-SMAD2-Mut 構(gòu)建完成后，以NIH-3T3 細(xì)胞為對象進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，分為pMIR-SMAD2-wt+miR-NC 組、pMIR-SMAD2-wt+miR-433 mimic 組、pMIR-SMAD2-Mut+miR-NC 組及 pMIRSMAD2-Mut+miR-433 mimic 組。轉(zhuǎn)染 24 h 后，使用雙螢光素酶檢測試劑盒檢測螢光素酶活性，以螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶活性的比值作為相對熒光素酶活性。

2.4 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 使用Trizol 從細(xì)胞中提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照RT-qPCR試劑盒制造商執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR，miR-433 的表達(dá)水平以U6為內(nèi)參照，SMAD2、FN、α-SMA和CTGF的mRNA表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。miR-433的上游引物序列為5'-TGCGGTACGGTGAGCCTGTC-3'，下游引物序列為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6的上游引物序列為5'-CGCAAGGATGACACG-3'，下游引物序列為5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'；SMAD2的上游引物序列為5'-ACCGAAATGCCACGGTAGAA-3'，下游引物序列為5'-TGGGGCTCTGCACAAAGAT-3'；FN的上游引物序列為5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAAT?GG-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-CACTGAAGCAG?GTTTCCTCGGTTGT-3'；α-SMA的上游引物序列為5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3'，下游引物序列為 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3'；CTGF 的上游引物序列為5'-GCGAAGCTGACCTG?GAGGA-3'，下游引物序列為5'-CGCACGAGTGGTG?GTTCTGTGCG-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC-3'，下游引物序列為5'-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3'。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 采用RIPA 裂解液提取細(xì)胞蛋白，遵照BCA法測定蛋白濃度，加入緩沖液后變性蛋白。每泳道加入50μg 蛋白，用12%SDS-PAGE 分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液37℃封閉1 h。加入I 抗［抗SMAD2、FN、α-SMA、CTGF 和 p-SMAD2 抗體（1∶500），抗 GAPDH 抗體（1∶1 000）］，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔Ⅱ抗（1∶1 000），室溫孵育1 h。TBST 洗滌3 次，每次15 min。ECL 液暗室發(fā)光顯影，采集圖像并分析。

2.6 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 NIH-3T3細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種于96 孔板，每孔200 μL 細(xì)胞懸液，分組培養(yǎng)后，按照CCK-8 試劑盒說明書，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育 1～2 h 后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（A）。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 預(yù)處理的NIH-3T3細(xì)胞用預(yù)冷的PBS重懸，將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷的70%乙醇中固定，置于4℃過夜。去除乙醇后，加入100 μL RNase A，37℃水浴30 min，接著添加400μL PI 染色并混勻，4℃避光30 min，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況。

2.8 建立矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型 將C57BL/6 小鼠分為假手術(shù)（sham）組、SiO2+miR-NC 組和 SiO2+miR-433 組，飼養(yǎng)于 20～23℃、40%～75% 濕度、12 h 光/暗周期條件下，自由獲取水和食物，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 周后構(gòu)建動物模型。使用0.2 mL 的1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，然后頸部去毛并消毒，首先用眼科剪剪開外層的皮膚，進(jìn)行鈍性分離，輕柔逐層暴露氣管，進(jìn)行氣管灌注：SiO2+miR-433組小鼠以200 nmol/kg agomiR-433和50 mg/kg矽塵并加入50μL生理鹽水；SiO2+miR-NC組小鼠以200 nmol/kg agomiR-NC 和 50 mg/kg 矽塵并加入 50 μL 生理鹽水；sham 組小鼠以等體積生理鹽水進(jìn)行灌注。灌注后，迅速將各組小鼠直立并輕輕旋轉(zhuǎn)2 min，使溶液和生理鹽水盡可能均勻地分布于小鼠的左右肺內(nèi)。待各組小鼠清醒后，進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，然后每周尾靜脈注射120 nmol//kg agomiR-433 或agomiR-NC。造模28 d 后處死小鼠，取肺組織樣本，甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，采用HE 染色和Masson 染色對小鼠肺纖維化進(jìn)行分析（從每張切片中選取3 個(gè)不重疊的視野圖片，計(jì)算膠原纖維染色的積分吸光度）。

2.9 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫處理水化組織切片，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。切片使用預(yù)先配制好的檸檬酸緩沖液進(jìn)行酸固定，然后使用微波加熱程序進(jìn)行抗原修復(fù)，5%正常羊血清室溫封閉15 min，加抗α-SMA抗體（1∶100），4℃過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗（1∶200）常溫孵育30 min；DAB 顯色后，蘇木精室溫染色2 min，脫水，中性樹脂封片，采用正置顯微鏡觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-433與SMAD2的靶向調(diào)控關(guān)系

采用TargetScan 軟件預(yù)測miR-433 潛在的靶基因，結(jié)果顯示，miR-433 在 SMAD2 的 3'-UTR 上有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，見圖1A。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-433 mimic能明顯抑制SMAD2野生型3'-UTR 螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-SMAD2-wt 的螢光素酶活性，而對SMAD2 突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-SMAD2-Mut的螢光素酶活性無明顯影響，見圖1B。Western blot 檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-433 mimic能抑制SMAD2 蛋白的表達(dá)（P＜0.01），見圖1C，同時(shí)SMAD2 的mRNA 表達(dá)水平較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖 1D。上述結(jié)果表明，miR-433 能與SMAD2的3'-UTR結(jié)合并抑制SMAD2的表達(dá)水平。

2 TGF-β1對NIH-3T3細(xì)胞miR-433表達(dá)的影響

與對照組相比，TGF-β1 處理 NIH-3T3 細(xì)胞后，miR-433的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），見圖2A；而NIH-3T3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-433 mimic 后，miR-433 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），見圖2B。

3 miR-433對NIH-3T3細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 和 RT-qPCR 結(jié)果顯示，TGF-β1 刺激能明顯上調(diào)NIH-3T3 細(xì)胞p-SMAD2 蛋白水平，同時(shí) FN、α-SMA 和 CTGF 蛋白和 mRNA 的表達(dá)較對照組也明顯升高（P＜0.01），而轉(zhuǎn)染miR-433 mimic 能逆轉(zhuǎn) TGF-β1 對 NIH-3T3 細(xì)胞 FN、α-SMA 和 CTGF 蛋白及mRNA 表達(dá)的作用，同時(shí)抑制TGF-β1 信號通路中關(guān)鍵信號分子SMAD2 蛋白的磷酸化（P＜0.01）。上述結(jié)果提示 miR-433 可抑制TGF-β1/SMAD2 信號通路的活化。

4 miR-433對NIH-3T3細(xì)胞活力和周期的影響

Figure 1.Targeting relationship between miR-433 and SMAD2.A：the target gene of miR-433 was predicted by software；B：the re?sults of dual-luciferase reporter assay；C：RT-qPCR was used to detect the expression of SMAD2 mRNA in NIH-3T3 cells；D：the protein expression of SMAD2 in NIH-3T3 cells was detected by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs miR-NC group.圖1 miR-433與SMAD2的靶向調(diào)控關(guān)系

Figure 2.The expression of miR-433 in the NIH-3T3 cells treated with TGF-β1.A：the expression level of miR-433 was detected by RT-qPCR after the NIH-3T3 cells were treated with TGF-β1；B：the expression level of miR-433 in the NIH-3T3 cells transfected with miR-433 mimic was detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.圖2 TGF-β1處理NIH-3T3細(xì)胞后miR-433表達(dá)的變化

采用CCK-8 法檢測上述3 組NIH-3T3 細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，TGF-β1+miR-NC 處理組細(xì)胞的活力較對照組明顯升高（P＜0.01），而轉(zhuǎn)染miR-433 mimic能逆轉(zhuǎn)TGF-β1 對細(xì)胞活力的影響（P＜0.05），見圖4A。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期的分布，結(jié)果顯示，與對照組相比，TGF-β1能增加處于S期的細(xì)胞數(shù)量，而miR-433 過表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF-β1 誘導(dǎo)的S期阻滯（P＜0.01），見圖4B。上述結(jié)果表明miR-433能抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的 NIH-3T3 細(xì)胞生長及 S 期阻滯。

Figure 3.The effect of miR-433 on the protein（A）and mRNA（B）expression of fibrosis-releted molecules in NIH-3T3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs TGF-β1+miR-NC group.圖3 miR-433對成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響

Figure 4.The effect of miR-433 on the viability（A）and cell cy?cle distribution（B）of NIH-3T3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs TGF-β1+miR-NC group.圖4 miR-433對NIH-3T3細(xì)胞活力和周期分布的影響

5 miR-433對小鼠肺纖維化的影響

為觀察miR-433 對小鼠肺纖維化的影響，采用agomiR-433 對矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型進(jìn)行干預(yù)。HE 染色結(jié)果顯示，與sham 組相比，SiO2+miRNC 組的肺纖維化程度加重，而SiO2+miR-433 組的肺纖維化面積較SiO2+miR-NC 組明顯降低，病變較輕；同時(shí)，Masson染色結(jié)果也顯示，SiO2+miR-NC組中有大量的藍(lán)色膠原沉積，而SiO2+miR-433 組中膠原沉積明顯減少（P＜0.01），見圖5。采用免疫組化檢測小鼠肺組織中纖維化標(biāo)志物α-SMA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，SiO2+miR-NC 組中α-SMA 的表達(dá)明顯高于sham組，而SiO2+miR-433組中α-SMA的表達(dá)較SiO2+miR-NC 組明顯降低（P＜0.01），見圖6。上述結(jié)果均表明，過表達(dá)miR-433 能減輕矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，提示miR-433可能具有抗肺纖維化作用。

討 論

吸入結(jié)晶性SiO2引起的矽肺病是一種慢性進(jìn)行性肺部纖維化疾?。?］。越來越多的證據(jù)表明，SiO2顆粒會激活巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，從而釋放出氧化型氧化劑和細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并最終導(dǎo)致纖維化（矽肺）［9］。盡管矽肺的致病因素很明確，但矽肺的復(fù)雜生物學(xué)和分子機(jī)制尚未得到充分闡明。

近幾年，miRNAs 在肺纖維化中的潛在作用被提出，Wu 等［10］研究發(fā)現(xiàn) miR-489 可通過靶向 MyD88和 SMAD3 抑制二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化，Ji 等［11］發(fā)現(xiàn) ，miR-21、miR-455、miR-151-3p、miR-486-5p 和miR-3107等5種miRNA 在肺纖維化小鼠模型中表達(dá)失調(diào)。在本研究中，通過TargetScan 軟件預(yù)測SMAD2為miR-433 的潛在靶基因，隨后使用雙螢光素酶報(bào)告基因、Western blot 等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，miR-433能特異性結(jié)合SMAD2的3'-UTR，并抑制其蛋白和mRNA 的表達(dá)，這些結(jié)果證明了SMAD2是miR-433的靶基因。

Figure 5.HE staining and Masson staining results of pulmonary fibrosis in mice（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs SiO2+miR-NC group.圖5 小鼠肺組織HE染色和Masson染色結(jié)果

Figure 6.The expression of α-SMA in the lung tissue of the mice（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs SiO2+miR-NC group.圖6 免疫組化檢測小鼠肺組織中α-SMA的表達(dá)

TGF-β1 是重要的促纖維化細(xì)胞因子，已有研究證明TGF-β1 在肺纖維化患者和動物的肺組織中高表達(dá)［12-13］。同時(shí)在肺纖維化過程中，miR-21、miR-155、miR-154等都受TGF-β1的調(diào)控［14］。本研究發(fā)現(xiàn)SMAD2受miR-433的靶向調(diào)控，而SMAD2是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要效應(yīng)分子［15-16］，因此，我們推測miR-433 與TGF-β1 存在相互作用。在本研究中，我們使用 TGF-β1 處理 NIH-3T3 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，miR-433的表達(dá)水平明顯降低，提示miR-433 表達(dá)水平的變化可能與TGF-β1有關(guān)。為進(jìn)一步研究miR-433在纖維化中對TGF-β1/SMAD 信號通路的影響，我們將miR-NC和miR-433 mimic分別轉(zhuǎn)染進(jìn)NIH-3T3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) TGF-β1 處理轉(zhuǎn)染 miR-NC 細(xì)胞后，p-SMAD2 蛋白明顯升高，并且 FN、α-SMA 和CTGF 蛋白和mRNA的表達(dá)也明顯高于對照組。同時(shí)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TGF-β1 能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染miR-NC 細(xì)胞的活力和S期細(xì)胞數(shù)量明顯增加。但在轉(zhuǎn)染miR-433 mimic 細(xì)胞中，TGF-β1 的這些促纖維化效果會因miR-433 的過表達(dá)而被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果提示，miR-433能通過抑制TGF-β1/SMAD信號通路發(fā)揮抗纖維化的作用。

在本研究中，我們首先采用agomiR-433 對矽塵誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型進(jìn)行干預(yù)，并通過HE染色及Masson 染色發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-433 能減少肺纖維化面積，抑制矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進(jìn)程。肌成纖維細(xì)胞是造成細(xì)胞外基質(zhì)沉積的主要細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)是肺纖維化過程中的關(guān)鍵步驟［17］。而α-SMA 則是肌成纖維細(xì)胞特異的標(biāo)志蛋白，是研究肌成纖維細(xì)胞活化的關(guān)鍵性蛋白［18］。我們進(jìn)一步通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用agomiR-433干預(yù)能明顯降低小鼠肺組織中α-SMA 的表達(dá)水平，這些結(jié)果均提示miR-433可能具有抗肺纖維化作用。

綜上所述，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-433 能減輕矽塵誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，且miR-433 可能通過靶向調(diào)控SMAD2抑制TGF-β1/SMAD信號通路，從而參與調(diào)節(jié)纖維化的進(jìn)程。