隗世波,劉青云 ,石雅嫻
(武漢科技大學(xué) 1附屬漢陽醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,2職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室,湖北武漢430050)
膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征。全球每年膿毒癥患者超過1 900 萬例,其中600 萬人死亡,而存活的患者大多數(shù)存在認(rèn)知功能障礙[1]。膿毒癥與多器官功能衰竭有關(guān),急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是膿毒癥患者常見的致死性并發(fā)癥。據(jù)報道,臨床上大約50%的AKI 是由膿毒癥引起,患者的死亡率達50%~70%[2]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有免疫調(diào)節(jié)、促進組織再生修復(fù)和抗氧化應(yīng)激損傷等功能,是近年來研究的熱點[3]。既往大量研究證實,移植BMSCs 可以提高膿毒癥AKI 大鼠的存活率[4-5]。然而,移植微環(huán)境會影響細胞的存活,并且可能限制其向靶器官分化,削弱了BMSCs 移植修復(fù)損傷組織和器官的能力,成為干細胞治療中的一個重點和難點。
白細胞介素33(interleukin-33,IL-33)是IL-1 家族成員,因為具有抗炎作用而受到廣泛關(guān)注。IL-33可以促進Th1細胞向Th2細胞轉(zhuǎn)化,從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。研究顯示,用IL-33基因修飾BMSCs可減少其凋亡,并影響T 細胞增殖和巨噬細胞計劃,進而改善心梗后大鼠的心臟功能[6]。有研究表明,IL-33可以通過其受體ST2發(fā)揮減輕膿毒癥和急性腎損傷的作用[7-9]。髓樣分化因子88(myeloid differen?tiation factor 88,MyD88)是IL-33 的靶分子,在膿毒癥AKI 發(fā)病中有重要意義[10]。轉(zhuǎn)基因治療是通過基因修飾,用目的基因轉(zhuǎn)染細胞并回輸體內(nèi)。本研究利用基因工程方法將IL-33轉(zhuǎn)染入BMSCs,然后對膿毒癥AKI 大鼠進行干預(yù),檢測治療后腎組織中促炎細胞因子及MyD88的表達情況,旨在觀察IL-33修飾的BMSCs治療膿毒癥AKI的效果。
80 只SPF 級雄性SD 大鼠,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京)2006-2009],6~8 周齡,體重約(250±20)g。允許大鼠自由攝食和飲食,飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22℃,濕度60%,明暗周期12 h/12 h。將大鼠隨機分為對照(control)組、模型(model)組、陰性轉(zhuǎn)染(negative transfection)組(移植未轉(zhuǎn)染的BMSCs)和IL-33轉(zhuǎn)染(IL-33transfec?tion)組(移植轉(zhuǎn)染IL-33的BMSCs),每組20只。
大鼠 BMSCs(Thermo Fisher Scientific);胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素(武漢華美公司);PCR 檢測試劑盒(Sigma);TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司);IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和MyD88 多克隆抗體(Bioworld)。CKX53 倒置相差顯微鏡(Olympus);AU680全自動生化儀(Beckman Coulter);ImageQuant LAS 4000成像系統(tǒng)(GE Healthcare)。
3.1 BMSCs 的培養(yǎng)及鑒定 將100 mL 胎牛血清及10 mL 抗生素(青霉素和鏈霉素1∶1 混合液)加入1 L DMEM 培養(yǎng)基,混勻后稀釋10 倍。吸取BMSCs 懸浮液加入培養(yǎng)液,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),2 d 換液1次。待細胞融合80%時去除培養(yǎng)液,吸取貼壁細胞,用3%胰蛋白酶消化3 min。隨后用含10%胎牛血清的低糖培養(yǎng)液終止消化,制備細胞懸液,接種于細胞培養(yǎng)瓶中,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定細胞表面標(biāo)志物 CD34、CD45、CD29、CD73 和CD90。傳代培養(yǎng)至第3 代的細胞可發(fā)出較強的熒光,用熒光顯微鏡觀察傳代細胞的形態(tài)。
3.2IL-33轉(zhuǎn)染和RT-qPCR 檢測 首先用PCR 技術(shù)擴增IL-33cDNA(上游引物序列為5'-GGAACAACA?CAGCAAGCAAAGCCT-3',下游引物序列為5'-TA?AGGCCAGAGCGGAGCTTCATAA-3';由蘇州合惠生物科技有限公司設(shè)計并提供),隨后構(gòu)建IL-33慢病毒載體,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸埃希菌 DH5α,用IL-33慢病毒感染第 3 代 BMSCs[11]。用 RT-qPCR 法檢測轉(zhuǎn)染后 BMSCs 中 IL-33 mRNA 的表達情況。用Trizol 法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進行qPCR 檢測。每個樣本最少重復(fù)3 次,設(shè)置3 個復(fù)孔。反應(yīng)條件為:預(yù)變性 95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40 個循環(huán)。IL-33 的上游引物序列為5'-TTGGAGA?ATGGATGTTACGTG-3',下游引物序列為5'-ACCAT?CAGCTTCTTCCCATC-3';內(nèi)參照 GAPDH 的上游引物序列為5'-GGCATTGCTCTCAATGACAAC-3',下游引物序列為5'-TGCTCTCAGTATCCTTGCTG-3'。
3.3 膿毒癥大鼠模型的建立及BMSCs 移植 用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)法建立膿毒癥大鼠模型[12],操作如下:用2%戊巴比妥腹腔注射(20 mg/kg)進行麻醉,取腹部正中切口,長度約1 cm;逐層打開腹膜,找到盲腸后游離其遠端,將盲腸內(nèi)糞便擠向遠端,用3 號絲線結(jié)扎盲腸中段并用12 號針頭在盲腸遠端穿孔2 次,擠壓少許糞便于盲腸表面,然后將盲腸回納,縫合腹膜、關(guān)閉腹腔。術(shù)后單籠飼養(yǎng)。術(shù)后24 h,陰性轉(zhuǎn)染組大鼠經(jīng)尾靜脈注射BMSCs 懸液10 μL[4];IL-33轉(zhuǎn)染組注射轉(zhuǎn)染成功的BMSCs 懸液10 μL;模型組大鼠尾靜脈注射10μL DMEM 培養(yǎng)液;對照組為正常大鼠,不給予任何干預(yù)。
3.4 腎功能檢測 移植前及移植后24、48 和72 h,從大鼠眼眶靜脈采血1.5 mL,用全自動生化檢測儀檢測血清肌酐(serum creatinine,SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平。
3.5 HE 染色觀察大鼠腎組織結(jié)構(gòu) 移植72 h 后,取大鼠右腎組織固定于10%中性福爾馬林,常規(guī)脫水、石蠟包埋,切片厚度為4 μm,進行HE 染色。方法如下:用無水乙醇浸沒蓋玻片20 min,PBS 漂洗3遍后浸入蘇木紫染液;用超離子水洗滌3 遍后將玻片浸入1%鹽酸酒精溶液中1 s;再用超離子水浸洗10 min;隨后浸入淡氨水中,10 min 后浸入伊紅染色液中10 min;超離子水沖洗,用95%乙醇脫水2次,無水乙醇脫水3 次,加入二甲苯,最后用中性樹脂封片,顯微鏡下觀察病理表現(xiàn)。采用改良Rabb 法對腎臟損傷進行評價,腎臟損傷包括12 種形態(tài)學(xué)變化:腎小球皺褶、腎小囊擴張、腎小球上皮細胞壞死等。每種損傷評價標(biāo)準(zhǔn):無病變,0 分;損傷范圍<5%,1分;損傷范圍5%~25%,2 分;損傷范圍25%~75%,3分;損傷范圍>75%,4分[13]。
3.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 移植72 h后,取大鼠腎組織做石蠟切片,用二甲苯清洗2 次,隨后用梯度乙醇浸洗1 次。用蛋白酶K(20 mg/L)處理組織20 min,在加入含20%過氧化氫的PBS。待玻片干燥后,加入50μL 的TUNEL 反應(yīng)混合液,蓋上蓋玻片在暗濕盒中反應(yīng)1 h。隨后加入反應(yīng)終止液,37℃下保存 20 min。在組織處加入 50 μL 的 DAB 底物,反應(yīng)15 min,后經(jīng)過梯度乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹脂封片。用熒光顯微鏡觀察切片,TUNEL 陽性細胞發(fā)出綠色熒光。
3.7 Western blot 檢測 IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4 和MyD88 的表達 樣品中加入SDS 緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。經(jīng)凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,用5%脫脂奶粉封閉1 h,孵育I 抗,4℃過夜,棄去I 抗,TBST 洗膜3 次,每次5 min。室溫孵育 II 抗 2 h,棄去 II 抗,TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。用 ImageQuant LAS 4000 成像系統(tǒng)顯色,以 β-actin 作為內(nèi)參,計算目標(biāo)蛋白條帶與β-actin灰度比值。
采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間均數(shù)比較采用重復(fù)測量方差分析或單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗;生存率比較用Kaplan-Meier法,兩兩比較用log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
傳代后BMSCs 生長迅速,4 d 后基本長滿瓶底,呈梭形,第1、2、3 代細胞增殖活躍,大部分細胞單層貼壁生長。當(dāng)細胞融合85%時,細胞均勻分布,細胞核和核仁清楚可見,呈漩渦狀分布,第3 代BMSCs 增殖速度明顯加快,生長旺盛,見圖1。流式細胞術(shù)檢測第3代BMSCs表面標(biāo)志物,其中,CD34和CD45陽性表達率分別為 0.7% 和 0.5%,CD29、CD73 和CD90 陽 性 率 分 別 為 98.4%、98.9% 和 99.1%,見圖2。
Figure 1.Morphological characteristics of the 3rd generation of BMSCs.A:BMSCs under an inverted microscope be?fore transfection;B:BMSCs under a fluorescence mi?croscope after transfection.Scale bar=200μm.圖1 BMSCs的形態(tài)學(xué)特征
轉(zhuǎn)染后BMSCs 中IL-33 mRNA 表達水平顯著升高(P<0.05),見圖3A,說明轉(zhuǎn)染IL-33成功,BMSCs中IL-33 呈高表達。模型組大鼠外周血和腎組織中IL-33 mRNA 表達水平顯著高于對照組,IL-33轉(zhuǎn)染組IL-33 mRNA 表達水平顯著高于模型組、對照組及陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05),見圖3B、C,說明尾靜脈注入轉(zhuǎn)染IL-33基因的BMSCs 后,血液和腎臟中IL-33 的表達水平顯著升高。
CLP后24 h,模型組大鼠出現(xiàn)躁動、寒戰(zhàn)、疲乏和豎毛現(xiàn)象。模型組大鼠處死后,肉眼可見腹腔內(nèi)有血性滲出液,盲腸變黑且粘連,腸管脹氣,部分大鼠有腸間和(或)腎周積膿。模型組大鼠的生存率顯著低于對照組(P<0.05);IL-33轉(zhuǎn)染組大鼠的生存率高于模型組和陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05),見表1。
Figure 2.Identification of the BMSCs by flow cytometry.圖2 流式細胞術(shù)鑒定BMSCs
Figure 3.The mRNA expression levels of IL-33 in BMSCs after transfection(A)and in peripheral blood(B)and kidney tissues(C)of the rats after transplantation.Mean±SD. n=20.*P<0.05 vs untransfected group;#P<0.05 vs control group;△P<0.05 model group.圖3 轉(zhuǎn)染后BMSCs中及移植后大鼠外周血和腎組織中IL-33的mRNA表達水平
表1 移植后各組大鼠的存活情況Table 1.Survival of the rats in each group after transplantation[n(%)]
模型組和陰性對照組大鼠SCr 和BUN 水平均高于對照組(P<0.05);IL-33轉(zhuǎn)染組大鼠SCr 和BUN 水平均顯著低于模型組和陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05),見表2、3。
表2 移植后各組大鼠SCr水平比較Table 2.Comparison of serum creatinine(SCr)levels in rats after transplantation(mg/dL.Mean±SD. n=20)
表3 移植后各組大鼠BUN水平比較Table 3.Comparison of blood urea nitrogen(BUN)levels in rats after transplantation(mg/dL.Mean±SD. n=20)
模型組和陰性轉(zhuǎn)染組大鼠可見明顯的腎小管損傷,包括上皮腫脹、刷狀邊界損失和嚴(yán)重管腔擴張,腎間質(zhì)可見炎癥細胞浸潤,腎小球有瘀血;模型組和陰性對照組大鼠腎臟組織病理損傷評分均顯著高于對照組(P<0.05),IL-33轉(zhuǎn)染組大鼠腎臟組織病理損傷評分顯著低于模型組和陰性轉(zhuǎn)染組(P<0.05),見圖4。
模型組和陰性轉(zhuǎn)染組腎組織凋亡細胞比例顯著高于對照組(P<0.05);與模型組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,IL-33轉(zhuǎn)染組腎臟組織凋亡細胞比例明顯降低(P<0.05),見圖5。
模型組和陰性轉(zhuǎn)染組大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α 和MyD88 蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05);與模型組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,IL-33轉(zhuǎn)染組IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4 及 MyD88 蛋白表達水平顯著下降(P<0.05),見圖6。
IL-33 屬于IL-1 家族成員,能夠促進T 淋巴細胞亞群介導(dǎo)的自身特異性變態(tài)反應(yīng),促進IL-4、IL-5 和IL-13 的分泌,增強 Th2 型免疫[11-13];同時,還可以促進自然殺傷細胞和自然殺傷T 細胞分泌IFN-γ,激活Th1 型免疫,在Th1/Th2 的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用[14-16]。有研究顯示,在膿毒癥動物模型中,IL-33可促進中性粒細胞向感染部位趨化,并促進IFN-γ的分泌,進而提高膿毒癥小鼠的存活率[17]。Cao 等[8]觀察到IL-33 可以預(yù)防缺血再灌注小鼠的腎結(jié)構(gòu)和功能損傷。但目前尚未見關(guān)于IL-33 治療膿毒癥AKI的效果及機制研究的報道。
Figure 4.The histomorphological changes of rat kidney tissues 72 h after transplantation(HE staining,scale bar=100μm)and com?parison of renal pathological injury scores.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs negative transfection group.圖4 移植72 h后HE染色觀察大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化和腎臟病理損傷評分比較
Figure 5.The apoptosis in rat kidney tissues was detected by TUNEL assay 72 h after transplantation(scale bar=100 μm).Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs negative transfection group.圖5 移植72 h后TUNEL法檢測大鼠腎組織細胞凋亡情況
本研究用IL-33基因?qū)MSCs 進行修飾,轉(zhuǎn)染后大鼠存活率顯著提高,并且腎功能指標(biāo)顯著改善。采用HE染色觀察大鼠腎組織病理學(xué)變化,結(jié)果顯示IL-33修飾的BMSCs 可以明顯改善腎臟病理損傷,同時可顯著降低膿毒癥AKI 大鼠腎臟組織細胞凋亡比例,提示IL-33修飾的BMSCs 可顯著減輕膿毒癥AKI大鼠的腎臟損傷,減少腎組織細胞凋亡,提高大鼠存活率。
Figure 6.The expression levels of IL-1β,IL-6,TNF-α,TLR4 and MyD88 in kidney tissues of rats in each group 72 h after transplan?tation.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs negative transfection group.圖6 移植72 h后各組大鼠腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4和MyD88蛋白表達水平
研究顯示,TLR4/MyD8 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膿毒癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[18]。郭皓等[19]的研究顯示,TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了膿毒癥AKI 的發(fā)生過程。TLR4 可釋放 IL-1β、IL-6、TNF-α 等多種炎癥因子,不僅可直接損害腎臟實質(zhì)細胞,還可激活依賴TLR4 的免疫細胞,誘導(dǎo)細胞因子,發(fā)揮腎損傷作用。研究顯示,使用TLR 拮抗劑可明顯減輕膿毒癥引起的 AKI[20]。還有研究顯示,IL-33 可以通過下調(diào)MyD88 促進 Th2 細胞分泌 IL-4 和 IL-13,進而發(fā)揮抗炎作用[21]。MyD88 的激活可以促進 IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達,進而引起細胞和組織發(fā)生炎癥性損傷[22-23]。因此 ,本研究推測 IL-33 可能通過調(diào)控TLR4/MyD88 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用。MyD88 是IL-33 下游的靶分子,與細胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)[24]。MyD88 與膿毒癥 AKI 的病理損傷密切相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示,IL-33修飾的BMSCs 治療后 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 表達水平均顯著下降,說明IL-33可能通過MyD88減輕腎組織炎性損傷,進而治療AKI。同時,與模型組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,IL-33轉(zhuǎn)染組TLR4 及MyD88 蛋白表達水平顯著下降,提示IL-33基因修飾的BMSCs 可能通過抑制TLR4/MyD88 的激活,減輕AKI 腎組織炎性損傷,改善腎功能。
綜上所述,IL-33基因修飾的BMSCs對膿毒癥大鼠AKI 的療效顯著,治療后大鼠腎臟病理損傷明顯減輕,細胞凋亡明顯減少,其機制可能與IL-33 調(diào)控TLR4/MyD88信號通路、抑制腎臟炎癥反應(yīng)有關(guān)。未來需要進一步進行機制研究,以明確IL-33 對BMSCs的作用及對AKI腎臟的保護作用。