易 揚(yáng)，陳 緣，蔣遠(yuǎn)霞，楊海波△，謝愷慶△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，2微生物學(xué)教研室，廣西南寧530021）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是一類危害全球人類健康的重大疾病。高尿酸血癥是CKD 的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，是CKD 進(jìn)行性發(fā)展及預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。當(dāng)CKD 3～5 期的患者伴有高尿酸血癥時(shí)，腎功能快速進(jìn)展且達(dá)到腎替代治療的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高［2-3］。在人體循環(huán)中，尿酸（uric acid，UA）通常以弱酸的形式溶于細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)pKa為5.8、pH 為7.40 的情況下，98%的尿酸以可溶性尿酸的形式釋放于細(xì)胞外。相關(guān)文獻(xiàn)表明，可溶性尿酸可引起腎小管上皮細(xì)胞慢性損傷及腎間質(zhì)炎癥，導(dǎo)致腎質(zhì)纖維化加重，加速了CKD 的發(fā)展進(jìn)程［4］。自噬是一種細(xì)胞回收過(guò)程，涉及自我降解和重建受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)，目前的證據(jù)表明自噬在腎臟疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［5-6］。最新研究表明，病原相關(guān)分子模式外源性分子和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式可激活Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，同時(shí)TLR4 信號(hào)通路也可介導(dǎo)自噬異常。我們前期及前人研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與調(diào)控可溶性尿酸誘導(dǎo)的腎小管炎癥反應(yīng)［7-9］。本研究設(shè)計(jì)體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)，探討TLR4 與可溶性尿酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬的關(guān)系，為臨床延緩或防治CKD進(jìn)展提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞株

人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2購(gòu)自ATCC。

2 主要試劑和儀器

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和低糖DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO）；氯喹（chloroquine，CQ）和尿酸（Sigma）；兔抗人P62單克隆抗體和兔抗人LC3B單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；兔抗人TLR4多克隆抗體（Abcam）；TLR4抑制劑TAK242（MCE）；Western blot 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑（索萊寶）；自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GTP-LC3（上海漢恒生物）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）；垂直電泳-轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad）。

3 方法

3.1 尿酸和自噬干預(yù)劑及正常對(duì)照試劑的制備0.5 g 尿酸和少許雙蒸水制成混懸液，用1 mol/L NaOH 滴定至澄清，再用雙蒸水補(bǔ)足至10 mL，制成50 g/L 的溶液，經(jīng)過(guò)0.22μm 濾膜除菌備用。將配制可溶性尿酸等量的NaOH 加入雙蒸水補(bǔ)足至10 mL，配成NaOH 溶液作為對(duì)照組的試劑。可溶性尿酸在干預(yù)之前用偏光顯微鏡檢測(cè)沒(méi)有尿酸晶體，在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)尿酸結(jié)晶。自噬干預(yù)劑氯喹按照說(shuō)明書(shū)方法制備成溶液備用。

3.2 HK-2 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 HK-2 細(xì)胞于37℃、5% CO2條件下，用含10% FBS 及1%雙抗的低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。HK-2 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化液消化后，用含10% FBS 低糖DMEM 培養(yǎng)液重懸，以每孔 1×105細(xì)胞數(shù)接種于 6 孔板中，置 37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞隨機(jī)分為以下4 組：正常對(duì)照（control）組、UA（120 mg/L）組、CQ（10 μmol/L）組和UA（120 mg/L）+CQ（10μmol/L）組，各藥物作用HK-2 細(xì)胞 12 h。在使用 TLR4 抑制劑 TAK242 的實(shí)驗(yàn)中設(shè)對(duì)照組、UA（120 mg/L）組和TAK242（1μmol/L）+UA（120 mg/L）組，分別刺激 HK-2 細(xì)胞4 h 和24 h。經(jīng)pH 檢測(cè)儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組培養(yǎng)液pH值，各組細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的pH 值保持在6.5～7.0 范圍內(nèi)。

3.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 根據(jù)RIPA Lysis Buffer說(shuō)明書(shū)提取HK-2細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE分離后切取目的條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用封閉液室溫封閉1 h。將封閉好的PVDF 膜使用TBST 洗3次，每次5 min，加入Ⅰ抗［抗LC3B、P62 和TLR4 抗體（1∶500），抗GAPDH 抗體（1∶1 000）］，在4℃?zhèn)葦[搖床上緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜，TBST 洗3 次，每次5 min。之后PVDF膜加入稀釋好的Ⅱ抗，搖床上緩慢搖動(dòng)孵育 1 h 后用 PBST 洗滌 3 次，最后采用 Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析。條帶經(jīng)掃描后，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics）進(jìn)行灰度值計(jì)算分析。

3.4 透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量 將HK-2 細(xì)胞接種于6 孔板之中培養(yǎng)，按照上述分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。用含有EDTA 的胰酶進(jìn)行消化，3～5 min 后觀察到細(xì)胞變圓或部分脫壁后，反復(fù)輕柔吹打，盡可能使全部的貼壁細(xì)胞混懸，巴氏吸管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清；將3%的戊二醛溶液加入離心管中，加入量必須沒(méi)過(guò)細(xì)胞沉淀，將離心管放置于4℃冰箱內(nèi)固定2 h 以上；固定好的標(biāo)本送電鏡室進(jìn)行包埋、超薄切片后置于透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的變化并拍照記錄。

3.5 自噬雙標(biāo)腺病毒實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞內(nèi)自噬流 將HK-2 細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞鋪滿50%時(shí)采用自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。24～36 h 后按照上述分組進(jìn)行干預(yù)，在共聚焦顯微鏡下觀察。每孔取5 個(gè)視野觀察并拍照。mRFP-GFP-LC3 雙標(biāo)腺病毒中表達(dá)的GFP 和mRFP 熒光蛋白用于標(biāo)記及追蹤LC3，最后將處理好的標(biāo)本在共聚焦顯微鏡下觀察成像并拍照記錄，紅、綠熒光合并后可觀察到黃色斑點(diǎn)及紅色斑點(diǎn)，黃色斑點(diǎn)為自噬體，紅色斑點(diǎn)為自噬溶酶體。

3.6 RT-qPCR 檢測(cè) TLR4 在 HK-2 細(xì)胞中的 mRNA表達(dá) 提取各組細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 的含量及濃度，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 TLR4 的上游引物序列為 5′-CAGAGTTTCCTGCAATGGATCA-3′，下游引物序列為5′-GCTTATCTGAAGGTGTTGCACAT-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGA?AC-3′，下游引物序列為5′-TGGTGAAGACGCCAGT?GGA-3′。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，所有定量變量符合正態(tài)分布。多組均數(shù)的比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 可溶性尿酸刺激HK-2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

Figure 1.The protein expression of LC3-Ⅱ and P62 was detected by Western blot.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs UA group；△△P＜0.01 vs CQ group.圖1 HK-2細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

可溶性尿酸（120 mg/L）刺激HK-2 細(xì)胞12 h 后，Western blot 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，UA 組 LC3-Ⅱ和 P62 的蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與 UA 組相比，UA+CQ 組LC3-Ⅱ和P62 的蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

2 透射電鏡觀察可溶性尿酸刺激的HK-2細(xì)胞內(nèi)自噬小體

可溶性尿酸（120 mg/L）刺激HK-2 細(xì)胞12 h 后，透射電鏡下可看到UA 組HK-2細(xì)胞的胞質(zhì)中較對(duì)照組出現(xiàn)較多自噬體（圖2 白色箭頭所示），其內(nèi)包含著未消化的胞漿成分或細(xì)胞器，而自噬溶酶體少見(jiàn)，見(jiàn)圖2。

3 TAK242 對(duì)可溶性尿酸刺激HK-2 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 2.Autophagyosomes in the HK-2 cells（×500）.圖2 HK-2細(xì)胞內(nèi)的自噬體

可溶性尿酸（120 mg/L）刺激 HK-2 細(xì)胞 4 h 后，RT-qPCR 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，UA 組 TLR4 的mRNA 表達(dá)增高（P＜0.05），而TAK242抑制可溶性尿酸刺激HK-2 細(xì)胞TLR4 的 mRNA 表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖3A?？扇苄阅蛩岽碳K-2 細(xì)胞24 h 后Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，UA 組 LC3-Ⅱ和 P62 的蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；而與 UA 組相比，UA+TAK242 組的 LC3-Ⅱ和 P62 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3B。

Figure 3.The effects of TLR4 inhibitor TAK242 on the expression of TLR4，LC3-Ⅱ and P62.A：the mRNA expression of TLR4；B：the protein expression of TLR4，LC3-Ⅱ and P62.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs UA group.圖3 TLR4抑制劑TAK242對(duì)TLR4、LC3-Ⅱ和P62表達(dá)的影響

4 TAK242 對(duì)可溶性尿酸刺激HK-2 細(xì)胞自噬流的影響

自噬雙標(biāo)腺病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，可溶性尿酸（120 mg/L）刺激HK-2 細(xì)胞24 h 后，圖像中黃色斑點(diǎn)（圖4A 白色箭頭所示）顯著增多，且黃色斑點(diǎn)多于紅色斑點(diǎn)（圖4A 藍(lán)色色箭頭所示），即自噬小體顯著增多，且自噬溶酶體較少；而與UA 組相比，TAK242+UA 組圖像中黃色斑點(diǎn)減少，紅色斑點(diǎn)相對(duì)增多（P＜0.05），即TAK242+UA 組自噬小體減少，自噬溶酶體相對(duì)增多，表明自噬小體與溶酶體融合現(xiàn)象增多，形成自噬溶酶體的進(jìn)程更順暢，見(jiàn)圖4。

討 論

Figure 4.Changes of autophagy in HK-2 cells transfected with mRFP-GFP-LC3.A：the autophagic flux was observed by mRFP-GFPLC3（×600；arrows indicate different color dots within the cells；the yellow dots indicate autophagosomes，while the red dots indicate autophagolysosomes in merged images）；B：numbers of green and red dots per cell；C：numbers of autophago?somes（yellow dots in merged images）and autophagolysosomes（red dots in merged images）per cell.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs UA group.圖4 mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染后HK-2細(xì)胞內(nèi)自噬情況的變化

高尿酸血癥是CKD 的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，人體尿酸以可溶性尿酸及尿酸鹽結(jié)晶兩種形式存在。既往認(rèn)為，高濃度尿酸鹽或尿酸在適宜條件下析出結(jié)晶沉積于腎小管間質(zhì)引發(fā)癥性反應(yīng)是高尿酸血癥致腎損害的主要發(fā)病機(jī)制。許多并發(fā)高尿酸血癥的慢性腎臟疾病，其腎臟病理組織中尿酸鹽或尿酸結(jié)晶僅少量沉積于腎臟某些局部，甚至不能發(fā)現(xiàn)，而慢性尿酸腎病卻為彌漫性腎小管間質(zhì)病變及腎小動(dòng)脈硬化，用尿酸鹽結(jié)晶致病機(jī)制無(wú)法解釋此現(xiàn)象［3，10］。自噬是一種高度保守的分解代謝過(guò)程，用于清除細(xì)胞質(zhì)組分，包括蛋白質(zhì)聚集物和受損的細(xì)胞器。自噬的作用不僅是降解產(chǎn)物，它還是一個(gè)動(dòng)態(tài)的回收系統(tǒng)，為細(xì)胞修復(fù)和動(dòng)態(tài)平衡產(chǎn)生新的蛋白和能量。相關(guān)研究表明，自噬與腎臟的固有細(xì)胞，如足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞密切相關(guān)［11-12］。腎損傷時(shí)自噬可防止腎臟的損傷；相反，過(guò)度的激活和功能受損的自噬過(guò)程可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，加快疾病的發(fā)展和惡化［13］。LC3 是酵母 Atg8 蛋白的哺乳動(dòng)物同源物，在受到半胱氨酸蛋白酶催化后，LC3 的C 端甘氨酸基團(tuán)暴露而形成LC3-I，其在自噬相關(guān)蛋白的作用下形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定結(jié)合在自噬體膜表面上，直到與溶酶體融合。當(dāng)自噬增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)LC3-I 向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化增加，從而使得LC3-Ⅱ/LC3-I 比值增加，故LC3-Ⅱ的含量在一定的程度上反映了細(xì)胞的自噬水平［14］。定位于自噬體內(nèi)膜的LC3-Ⅱ和自噬體內(nèi)容物一起與溶酶體相互融合后，在溶酶體內(nèi)消化酶的作用下降解。當(dāng)氯喹干擾溶酶體內(nèi)pH 值使得消化酶活性降低時(shí)，則會(huì)使得自噬溶酶體降解能力下降，從而引起LC3-Ⅱ水平增加。然而，相關(guān)研究顯示，當(dāng)LC3-Ⅱ在自噬體內(nèi)堆積時(shí)，P62 水平也會(huì)相應(yīng)的增多，當(dāng)LC3-Ⅱ升高，P62 水平降低，表示自噬流通暢，溶酶體和自噬小體融合后降解；當(dāng)LC3-Ⅱ和P62 水平同時(shí)升高時(shí)，表明自噬啟動(dòng)正常，但下游自噬流不通暢，溶酶體和自噬小體不能融合形成自噬溶酶體，導(dǎo)致自噬小體蓄積在細(xì)胞內(nèi)［15］。本實(shí)驗(yàn)使用可溶性尿酸刺激HK-2 細(xì)胞后，LC3-Ⅱ、P62表達(dá)上調(diào)，加入氯喹刺激后，可以觀察到LC3-Ⅱ和P62 的水平進(jìn)一步表達(dá)增加，透射電子顯微鏡下觀察到自噬小體增多，自噬溶酶體少見(jiàn)，結(jié)果提示可溶性尿酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬，但自噬流下游不通暢。

TLR4 調(diào)控早期自噬的研究使科研人員將自噬與天然免疫聯(lián)系起來(lái)，他們認(rèn)為這是宿主對(duì)多種細(xì)胞內(nèi)病原體的防御反應(yīng)［16］。在感染過(guò)程中自噬的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，由許多受體介導(dǎo)，TLR4 可識(shí)別病原體的特定分子模式，在天然免疫和適應(yīng)性免疫中起著重要作用［17］。研究已證實(shí)，腎損傷時(shí)TLR4既可以激活依賴MyD88 信號(hào)通路也可激活非MyD88 依賴的信號(hào)通路調(diào)控自噬過(guò)程［10，18-19］。近年來(lái) TLR4 調(diào)控自噬在腎臟疾病中的作用已經(jīng)受到研究者的廣泛關(guān)注，但現(xiàn)有的資料顯示具體機(jī)制尚無(wú)確切定論。在不同原因?qū)е碌募甭阅I損傷中都有研究報(bào)道顯示TLR4 激活自噬對(duì)腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用；然而在順鉑導(dǎo)致的腎損傷模型中，TLR4 可介導(dǎo)自噬異常從而加劇腎小管損傷并對(duì)腎臟功能造成影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，TAK242 可明顯降低可溶性尿酸的誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞TLR4、LC3-Ⅱ和P62 的表達(dá)水平，提示TLR4 可參與調(diào)控可溶性尿酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的自噬。自噬雙標(biāo)腺病毒結(jié)果表明可溶性尿酸組自噬小體和自噬溶酶體增多，且自噬小體顯著多于自噬溶酶體，提示自噬增強(qiáng)，但自噬流不通暢；而加入TAK242 則可增加HK-2 細(xì)胞的自噬小體與溶酶體融合，緩解自噬流不通暢現(xiàn)象。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，可溶性尿酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬，但自噬流不通暢；同時(shí)，可溶性尿酸可通過(guò)TLR4 介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬流異常。