鐘桂蘭，周 知，王 茹，符山花，劉曉芳

［1海南省婦幼保健院（海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心）婦科，海南?？?72600；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040］

隨著對(duì)細(xì)胞自噬的深入研究，人們?cè)桨l(fā)認(rèn)識(shí)到自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，一方面自噬發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器更新和代謝需求，另一方面自噬可作為Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此研究自噬發(fā)生機(jī)制有利于臨床宮頸癌的治療［1-2］。有研究顯示，sirtuin 1（SIRT1）不僅可通過(guò)叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)oxO）調(diào)控自噬，也可調(diào)控氧化應(yīng)激，參與細(xì)胞凋亡、增殖等過(guò)程［3-4］，SIRT1-FoxO 信號(hào)通路有可能成為臨床上治療宮頸癌的新靶點(diǎn)。紫檀芪（pterostilbene，PTE）類屬于藜蘆醇同系物，具有抗腫瘤和激活細(xì)胞自噬的作用［5］，但PTE激活自噬的具體作用機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)觀察PTE 對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬的影響，探究其相關(guān)作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

PTE（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：B21702-20 mg；DMEM、CCK-8 試劑盒、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、RIPA 細(xì)胞裂解液和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；BCA 蛋白定量試劑盒和PVDF 膜購(gòu)自上海炎熙生物科技有限公司；兔抗人p62、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和 β-actin 抗體均購(gòu)自上海熹垣生物科技有限公司；兔抗人SIRT1 和FoxO抗體和羊抗兔IgG-HRP均購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒購(gòu)自上海群己生物科技有限公司。

SpectraMax M3 型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自MD；Attune NxT型流式細(xì)胞儀和iBright FL1500型智能成像系統(tǒng)均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；LVEM5 型臺(tái)式透射電子顯微鏡購(gòu)自Delong Instruments。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)液為含10% FBS 和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2、相對(duì)濕度98%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，根據(jù)CCK-8 實(shí)驗(yàn)測(cè)出PTE 對(duì) HeLa 細(xì)胞的 IC50，以 IC50為 PTE 最大作用濃度進(jìn)行分組，分別為0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L 和60μmol/L PTE組，再開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 方法

3.1 CCK-8 法測(cè)定PTE 對(duì)HeLa 細(xì)胞活力的影響收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa 細(xì)胞，用含有FBS 的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，按照每孔8×103個(gè)的數(shù)量接種至96孔板中。繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄去舊DMEM 培養(yǎng)液，加入200μL 含有不同濃度PTE（PTE 終濃度分別為0、2、5、10、20、40 和 80 μmol/L）的 DMEM 培養(yǎng)液［6］，培養(yǎng) 24 h 和 48 h 后，棄去舊 DMEM 培養(yǎng)液，各孔加入180μL DMEM 培養(yǎng)液和20μL CCK-8 溶液。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄舊培養(yǎng)液，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和0.1%DMSO 對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞活力抑制率（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照A值）/（對(duì)照組A值-空白對(duì)照A值）］×100%。用SPSS軟件計(jì)算PTE對(duì)HeLa細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定PTE 對(duì)HeLa 細(xì)胞凋亡率的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa 細(xì)胞，用含有FBS 的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，按照每孔2.0×105個(gè)的密度接種到6孔板上，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄去舊培養(yǎng)液，加終濃度含有 0、15、30 和 60 μmol/L PTE 的 DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h 后，棄去舊DMEM 培養(yǎng)液，避光條件下加入FITC 和PI，標(biāo)記細(xì)胞，具體操作按照An?nexin V-FITC/PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

3.3 透射電鏡觀察PTE 處理后HeLa 細(xì)胞中自噬體 HeLa 細(xì)胞經(jīng)0 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L 和60 μmol/L PTE 處理48 h 后，用胰酶消化，離心后，用預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，離心、棄上清液，2.5%戊二醛固定15 min，脫水、包埋、切片，枸櫞酸鉛染色，用透射電鏡觀察HeLa細(xì)胞中自噬體。

3.4 qPCR 測(cè)定 PTE 處理 后 HeLa 細(xì) 胞中 SIRT1 和FoxO 的mRNA 表達(dá) 采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行qPCR，用GAPDH 為內(nèi)參照。GAPDH 上游引物序列為5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，下游引物序列為5'-TGCACCACCAACTGTTAGC-3'；SIRT1 上游引物序列為5'-AGGCGGATTTCTGAGTTCGA-3'，下游引物序列為5'-CGTCCCTTGTAATGTTTCCC-3'；FoxO上游引物序列為5'-CTCATCACCAAGGCCATCGAG-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-CCATGGACG?CAGCTCTTCTC-3'。按試劑盒說(shuō)明建立終體積為20μL 的反應(yīng)體系：2 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10 μL SYBR Green Mix，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，7μL ddH2O。熱循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

3.5 Western blot 法測(cè)定 PTE 處理后 HeLa 細(xì)胞中SIRT1、FoxO、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、Bax和Bcl-2水平用RIPA 細(xì)胞裂解液裂解經(jīng)PTE 處理后的HeLa 細(xì)胞，4℃離心提取總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白含量，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。SDSPAGE 分離目標(biāo)蛋白（低壓80 V，30 min；高壓120 V，60 min），轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5% BSA 封閉，分別加入相應(yīng)兔抗人SIRT1、FoxO、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、Bax、Bcl-2 和β-actin I 抗（1∶1 000），孵育過(guò)夜，加入羊抗兔IgG-HRP II 抗（1∶2 000），孵育2 h，ECL 顯色，測(cè)定各蛋白條帶灰度值，蛋白相對(duì)含量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參照β-actin蛋白灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）形式表示。多組比較行單因素方差分析，任意兩組相比行SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PTE對(duì)HeLa細(xì)胞活力的影響

CCK-8 法結(jié)果顯示，PTE 作用于 HeLa 細(xì)胞 48 h后，細(xì)胞活力受到抑制，活力抑制率隨濃度增加而升高，具有濃度依賴性，見(jiàn)表1。PTE 對(duì)HeLa 細(xì)胞作用24 h 的 IC50為（53.87±5.48）μmol/L，48 h 的 IC50為（32.46±3.76）μmol/L，參照IC50值，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0、15、30和60μmol/L PTE進(jìn)行。

表1 不同濃度PTE對(duì)HeLa細(xì)胞活力的影響Table 1.The effect of different concentrations of PTE on the via?bility of HeLa cells（Mean±SD. n=6）

2 PTE促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡

為驗(yàn)證PTE 促進(jìn)HeLa 細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同濃度PTE 對(duì)HeLa 細(xì)胞凋亡率的影響，與0 μmol/L PTE 相比，15、30和60 μmol/L PTE 處理后，HeLa 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of different concentrations of PTE on the apoptosis rate of HeLa cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15μmol/L PTE；△P＜0.05 vs 30μmol/L PTE group.圖1 不同濃度PTE對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率的影響

3 PTE增加HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)目

通過(guò)透射電鏡觀察到，無(wú)PTE（0 μmol/L PTE）處理的HeLa 細(xì)胞中自噬體數(shù)目較少，經(jīng)15、30 和60μmol/L PTE 處理后，HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)目明顯增加，見(jiàn)圖2。

4 PTE 處理后 HeLa 細(xì)胞中 Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62水平比較

為進(jìn)一步確定PTE 處理對(duì)HeLa 細(xì)胞自噬和凋亡的作用，不同濃度PTE處理后，通過(guò)Western blot法測(cè)定相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與0 μmol/L PTE 相比，15、30和60μmol/L PTE處理后，HeLa細(xì)胞中Bax和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 和p62 水平顯著降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 2.Comparison of the number of autophagosomes in HeLa cells after PTE treatment（lead citrate staining，scale bar=1 or 2 μm）.The autophagosome are indicated by black arrow.圖2 PTE處理后HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)目比較

Figure 3.Western blot was used to detect the protein levels of Bcl-2，Bax，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ and p62 in HeLa cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15 μmol/L PTE group；△P＜0.05 vs 30μmol/L PTE group.圖3 Western blot 法檢測(cè) HeLa 細(xì)胞中 Bcl-2、Bax、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62蛋白水平

5 PTE 處 理 后 HeLa 細(xì) 胞 中 SIRT1 和 FoxO 的mRNA及蛋白表達(dá)

為研究 PTE 處理對(duì) HeLa 細(xì)胞 SIRT1/FoxO 通路的影響，不同濃度PTE處理后，通過(guò)Western blot法測(cè)定相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與0 μmol/L PTE 相比，經(jīng) 15、30 和 60 μmol/L PTE 處理后，HeLa 細(xì)胞中SIRT1 和FoxO 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

討 論

Figure 4．Expression of SIRT1 and FoxO in HeLa cells after PTE treatment.A：the mRNA expression of SIRT1 and FoxO detected by qPCR；B：the protein expres?sion of SIRT1 and FoxO detected by Western blot.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15 μmol/L PTE group；△P＜0.05 vs 30.0μmol/L PTE group.圖 4 PTE 處理 后 HeLa 細(xì) 胞中 SIRT1 和 FoxO 的 mRNA 及蛋白表達(dá)

宮頸癌發(fā)病率和病死率逐年升高，全球每年新增患者近50萬(wàn)人［7］，近年來(lái)，自噬在腫瘤進(jìn)程的作用受到越來(lái)越多研究者們的關(guān)注，有望成為腫瘤治療中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的新靶點(diǎn)。PTE 是主要從葡萄和藍(lán)莓中提取而來(lái)的天然化合物，是一種天然的抗氧化劑。最新研究顯示，PTE生物活性廣泛，具有顯著的抗腫瘤活性；研究顯示，PTE可激活人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞自噬，抑制其增殖，促進(jìn)其凋亡［8］。劉盛楠等［9］研究顯示 PTE 通過(guò)上調(diào) Bax、Fas、細(xì)胞色素C和caspase-3，下調(diào)Bcl-2，抑制HepG2細(xì)胞增殖并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。本研究觀察到，經(jīng)不同濃度PTE 處理后，HeLa 細(xì)胞活力抑制率、細(xì)胞凋亡率依次升高，提示PTE 可以抑制HeLa 細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡進(jìn)程，主要受抑凋亡因子Bcl-2 和促凋亡因子Bax 調(diào)控，本研究進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，PTE 處理后，HeLa 細(xì)胞中Bcl-2 水平降低，Bax 水平升高，提示 PTE 通過(guò)上調(diào) Bax、下調(diào)Bcl-2而抑制HeLa細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

自噬與腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，研究顯示，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)劑TIC10 聯(lián)合阿司匹林，可通過(guò)促進(jìn)自噬，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡［10］。LC3 由LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩個(gè)亞型組成，細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，LC3-Ⅰ經(jīng)加工形成LC3-Ⅱ，而p62 蛋白首先與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合，隨后與LC3-Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，從而被降解，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白水平常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生自噬［11-12］。研究顯示，PTE可通過(guò)上調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平，促進(jìn)人口腔癌細(xì)胞自噬，以抑制其增殖，促進(jìn)其凋亡［13］。本研究觀察到，經(jīng)PTE 處理后，HeLa 細(xì)胞中自噬體數(shù)目增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平升高，p62 水平降低，說(shuō)明 PTE 可促進(jìn)HeLa 細(xì)胞發(fā)生自噬，并通過(guò)此機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是PTE 通過(guò)調(diào)控何種信號(hào)通路誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞自噬還有待進(jìn)一步研究。

FoxO 主要由 FoxO1 和 FoxO3 組成，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡具有重要的調(diào)控作用。研究顯示，F(xiàn)oxO3 高表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡［14］。SIRT1 是FoxO3 的上游通路，可調(diào)控 FoxO3 水平，SIRT1 活化劑激活FOXO1 的脫乙酰作用后，可刺激人皮膚成纖維細(xì)胞發(fā)生自噬［15］。此外研究顯示，PTE 可通過(guò)激活SIRT1/FoxO1信號(hào)通路，避免人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞再灌注損傷［16］。本研究觀察到，PTE處理后，HeLa細(xì)胞中SIRT1 和FoxO 的mRNA 及蛋白水平升高，說(shuō)明PTE 調(diào)控細(xì)胞 SIRT1 和 FoxO 的 mRNA 及蛋白表達(dá)，推測(cè)PTE通過(guò)調(diào)控SIRT1-FoxO通路，調(diào)控自噬、凋亡相關(guān)因子表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡

綜上所述，PTE 可通過(guò)激活SIRT1-FoxO 通路抑制HeLa 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞自噬、凋亡。然而PTE作用后誘導(dǎo)的自噬與凋亡之間是否有關(guān)聯(lián)，以及PTE在體內(nèi)治療的作用有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。