古彩茹，林夢園，劉 威

（1廣州市紅十字會醫(yī)院，暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院婦科，廣東廣州510220；2深圳市人民醫(yī)院婦科，深圳518020；3廣州市紅十字會醫(yī)院，暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院乳腺科，廣東廣州510220）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位［1］。由于卵巢癌起病隱匿，確診時多處于晚期且伴有轉(zhuǎn)移，而復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者死亡的最主要原因。由于缺乏有效的治療藥物，患者一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，預(yù)后會很差。因此，在天然植物中尋找高效且毒副作用小的抗腫瘤藥物是可行的策略之一，也是目前卵巢癌治療的研究熱點。

芒柄花黃素（formononetin，F(xiàn)orm）是一種異黃酮類植物雌激素，是豆科植物紅三葉草的主要活性成分，也是常用中草藥當歸、黃芪、葛根等的活性成分之一。研究顯示，芒柄花黃素具有保護血管［2］、抗炎［3］、抗焦慮［4］、預(yù)防骨質(zhì)疏松［5］等方面的藥理作用。此外，芒柄花黃素還具有較強的抗腫瘤作用［6-7］，但具體的作用機制不明。本研究擬用芒柄花黃素作用于卵巢癌細胞進行體外實驗，觀察其對卵巢癌細胞活力、遷移與侵襲的影響。

材料和方法

1 主要材料與試劑

芒柄花黃素和二甲基亞砜購自Sigma；高糖DMEM 培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；人卵巢漿液性囊腺癌SKOV-3 細胞由中科院上海細胞生物研究所提供；實驗所用GAPDH、上皮鈣黏素（E-cadherin）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）I 抗及相應(yīng) II 抗均購自 Cell Signaling Technology；Trizol 裂解液、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 real-time PCR 試劑盒購自TaKaRa；PCR 引物由上海生工公司合成；MTS 試劑盒購自Promega；蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；總蛋白測定試劑盒購自Bio-Rad；ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo Scientific。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將SKOV-3 細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L 青 霉素和 100 mg/L 鏈 霉素的 高 糖DMEM 培養(yǎng)液，置于 37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTS 法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的SKOV-3 細胞，調(diào)整細胞濃度為5×106/L，每孔100 μL接種于96 孔板，依據(jù)李通等［8］采用的對結(jié)直腸癌的芝柄花黃素作用濃度，本研究選用20、50、100μmol/L 芒柄花黃素，每組6 個復(fù)孔，進行細胞活力測定實驗，作用48 h，對照組加入等體積新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h 后，每孔加入MTS 20 μL，孵育4 h，用酶標儀檢測吸光度（A）值，同時使用SPSS 19.0軟件probit回歸模型計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory con?centration，IC50）。實驗重復(fù)3次。

2.3 劃痕實驗 常規(guī)消化、離心收集SKOV-3 細胞并計數(shù)，然后按照每孔1×106個接種于6 孔板。在5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)至90%融合度時，在孔板中劃一十字型傷口。實驗組加入含50 μmol/L 芒柄花黃素的DMEM 完全培養(yǎng)液，對照組加入不含芒柄花黃素的DMEM 完全培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)48 h 后，觀察傷口愈合情況并拍照。實驗重復(fù)3次。

2.4 Transwell 侵襲實驗 用無血清培養(yǎng)液處理處于對數(shù)生長期的SKOV-3細胞，使其饑餓12h，經(jīng)胰酶消化、離心收集細胞并計數(shù)，用無血清DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×108/L。實驗前將Transwell 小室置于 24 孔板內(nèi)，用 200 μL 無菌吸頭迅速吸取 50 μL Matrigel 至預(yù)冷的Transwell 上室中，操作過程中避免氣泡形成，將包被好Matrigel 的Transwell 小室移入37℃孵箱中待其凝固。在小室上層加入200μL 的細胞懸液，同時分別加入無血清培養(yǎng)液（對照組）和含50μmol/L 濃度的芒柄花黃素，下室加入500μL 的含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。放入5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。結(jié)束培養(yǎng)后，用PBS緩沖液沖洗小室3 次，用棉簽輕輕擦去小室上層的細胞，將小室置于700 μL 甲醛中，室溫固定15 min，用PBS 緩沖液沖洗小室3 次。用0.2%結(jié)晶紫染色30 min，PBS 緩沖液充分清洗并晾干小室。倒置顯微鏡下拍照，每個小室取5 個不同視野求平均值。實驗重復(fù)3次。

2.5 RT-qPCR 檢測相關(guān)基因的表達變化 取對數(shù)生長期SKOV-3細胞，培養(yǎng)至70%～80%融合時，加入50μmol/L 的芒柄花黃素干預(yù)細胞，對照組加入新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h 后，提取細胞總RNA，取2μL 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 產(chǎn)物為模板，RT-qPCR 檢測E-cadherin 和 MMP-9 mRNA 的表達。內(nèi)參照 GAPDH 的上游引物序列為5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3'，下游引物序列為5'-GATTTTGGAGGGATCTCGCT-3'；E-cadherin 的上游引物序列為 5'-ACCTCTGT?GATGGAGGTC-3'，下游引物序列為5'-CCACATTC?GTCACTGCTACG-3'；MMP-9 的上游引物序列為5'-TCCAGTACCGAGAGAAAGCC-3'，下游引物序列為5'-GCAGGATGTCATAGGTCACG-3'。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)；72℃10 min。以ABI PRISM 7500 SDS軟件分析，以對照組目的基因mRNA 的均數(shù)為1，計算其他各組目的基因mRNA的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

2.6 Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達變化 通過消化、離心分別收集實驗組和對照組SKOV-3 細胞，用冰冷PBS 離心洗2 次，加入預(yù)冷的細胞裂解液，冰上裂解30 min 后，使用超聲破碎儀處理細胞，每次2 s，連續(xù)10 次（每次間隔2 s）。4℃、12 000×g離心 10 min，轉(zhuǎn)移含有細胞總蛋白的上清液到新的EP 管中。取少量上清液通過BCA 方法進行蛋白定量，其余蛋白用SDS 變性。以每孔30 μg 的蛋白含量上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加入5%脫脂奶粉溶液，室溫搖床上孵育2 h，加入GAPDH、E-cadherin 和MMP-9 I 抗（均1∶1 000）4℃孵育過夜，用TBST 緩沖液洗 4 次，每次 5 min，加入 II 抗（1∶5 000）于室溫搖床上孵育2 h，再用TBST 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。應(yīng)用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影并拍照。以GAPDH 作內(nèi)參照。Western blot 條帶灰度與內(nèi)參照條帶灰度比值通過Bio-Rad軟件進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 芒柄花黃素對SKOV-3細胞活力的影響

MTS 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，各濃度芒柄花黃素對SKOV-3細胞均有不同程度的抑制作用（P＜0.01），隨著藥物濃度增加，抑制作用越來越顯著，呈劑量依賴性（P＜0.05 或P＜0.01），見圖1。用SPSS 軟件計算得出芒柄花黃素對SKOV-3 細胞的IC50為47.55 μmol/L，因此，我們選擇接近IC50的50 μmol/L為芒柄花黃素的濃度進行后續(xù)實驗。

2 芒柄花黃素對SKOV-3細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，50μmol/L 芒柄花黃素處理48 h 后，SKOV-3 細胞遷移能力顯著下降（P＜0.01），見圖2。

3 芒柄花黃素對SKOV-3細胞侵襲能力的影響

Transwell 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，50μmol/L 芒柄花黃素組穿過小室膜的細胞數(shù)量顯著下降（P＜0.01），見圖3。

4 芒柄花黃素對SKOV-3 細胞中E-cadherin 和MMP-9 mRNA及蛋白表達水平的影響

RT-qPCR 和Western blot 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，50 μmol/L 芒柄花黃素組中 E-cadherin 的mRNA 及蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），而MMP-9 的 mRNA 及蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01），見圖4。

Figure 1.Effects of different concentrations of formononetin（Form）for 48 h on SKOV-3 cell viability.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs 0 μmol/L；##P＜0.01 vs 25 μmol/L；&P＜0.05 vs 50μmol/L.圖1 不同濃度芒柄花黃素作用48 h 對SKOV-3 細胞活力的影響

Figure 2.Effect of formononetin（Form）on SKOV-3 cell migra?tion（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L Form group.圖2 芒柄花黃素對SKOV-3細胞遷移的影響

討 論

Figure 3.Effects of formononetin on SKOV-3 cell invasion（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L Form group.圖3 芒柄花黃素處理SKOV-3細胞后對細胞侵襲力的影響

Figure 4.Effects of formononetin（Form）on the mRNA（A）and protein（B）expression of E-cadherin and MMP-9 in the SKOV-3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L Form group.圖4 芒柄花黃素對SKOV-3細胞E-cadherin和MMP-9表達的影響

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中致死率最高、預(yù)后最差的腫瘤。芒柄花黃素是一種生物活性異黃酮，其抗腫瘤作用日益受到人們的關(guān)注?，F(xiàn)有研究證實，芒柄花黃素對多種實體腫瘤細胞有抗腫瘤作用。芒柄花黃素可抑制小鼠宮頸癌的發(fā)展［9］及肺癌細胞的增殖與侵襲［10］。Chen 等［11］的研究表明，芒柄花黃素通過microRNA-375-RASD1-ERα 途徑參與乳腺癌細胞的增殖。Wu 等［12］的研究顯示，芒柄花黃素通過調(diào)節(jié)miR-21 和PTEN 抑制膀胱癌細胞的增殖與侵襲。然而芒柄花黃素對卵巢癌影響的相關(guān)研究較少，作用機制亦不明確。在本研究中，我們檢測了芒柄花黃素對卵巢癌SKOV-3細胞活力的影響，結(jié)果顯示芒柄花黃素對SKOV-3 細胞的抑制率隨藥物濃度的增加而增加，這表明芒柄花黃素能夠劑量依賴性抑制卵巢癌細胞活力，初步顯示芒柄花黃素對SKOV-3細胞的抗腫瘤效用。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程受到多種因素的影響，是一個涉及多階段和多步驟的復(fù)雜過程［13］。腫瘤細胞間黏附喪失是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的第一步。研究顯示E-cadherin 參與此過程調(diào)節(jié)，E-cadherin 是上皮細胞的標志物，通過調(diào)節(jié)細胞與基質(zhì)間或細胞與細胞間的黏附反應(yīng)來維持組織結(jié)構(gòu)的完整性［14］。研究顯示，E-cadherin 在多種腫瘤中表達降低，如腎細胞癌［15］、胃癌［16］、乳腺癌［17］和肺癌［18］等，揭示 E-cadherin 低表達與腫瘤的發(fā)生、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。因此，本研究在明確芒柄花黃素能夠有效抑制卵巢癌細胞活力的基礎(chǔ)上，進一步檢測芒柄花黃素對SKOV-3 細胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，芒柄花黃素顯著降低SKOV-3細胞的遷移和侵襲能力，且可導(dǎo)致E-cadherin表達顯著增加。

除了腫瘤細胞間黏附喪失外，細胞外基質(zhì)的降解也是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵步驟之一。研究證實，MMPs 是細胞外基質(zhì)降解的重要因子，能夠促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，改變細胞間的黏附力和導(dǎo)致腫瘤新生血管形成［19］。MMP-9 作為 MMPs 家族中重要的成員，能夠降解明膠和IV 型膠原，進而對細胞外基質(zhì)進行降解，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。已有研究證實，MMP-9 在透明細胞腎癌［20］、子宮內(nèi)膜癌［21］、肺癌［22］、黑色素瘤［23］、結(jié)腸癌［24］和鼻咽癌［25］等多種腫瘤中高表達且與患者預(yù)后差相關(guān)，同時與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有著緊密的關(guān)系。研究顯示，MMP-9的表達水平也與卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)［1，26］。在本研究中，我們用芒柄花黃素作用于卵巢癌細胞后，觀察到MMP-9 的表達顯著下降，說明芒柄花黃素可能通過下調(diào)MMP-9來抑制卵巢癌細胞的遷移與侵襲。

綜上所述，我們證明了芒柄花黃素呈劑量依賴性抑制卵巢癌SKOV-3細胞的活力、遷移和侵襲。此外，芒柄花黃素能夠上調(diào)E-cadherin 和下調(diào)MMP-9 mRNA 及蛋白的表達水平，這可能是芒柄花黃素抑制卵巢癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的可能機制之一，但芒柄花黃素對卵巢癌細胞更具體的作用機制仍有待深入的研究。