申屠樂，陳夢靜，李影影，李 菲

（浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，浙江杭州310005）

卵巢癌是婦科最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率較高，且具有低齡化發(fā)展的趨勢。由于卵巢癌缺乏早期癥狀和早期診斷的檢測手段，當卵巢癌被確診時，通常已是晚期［1］。因此，如何盡早預防和尋找有效治療手段一直是卵巢癌研究的重點。

粉防己堿（tetrandrine）是一種雙芐基異喹啉類生物堿，是從防己科植物粉防己的塊根中提取的主要有效成分。粉防己堿作為傳統(tǒng)中藥已被廣泛應用于臨床，有消炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗纖維化等廣泛的藥理作用［2］。近年來研究顯示，粉防己堿能抑制多種腫瘤細胞增殖，作為一潛在的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤作用受到研究者的重視［3］。自噬在腫瘤細胞中具有雙重作用，一方面，它能起到細胞的保護作用；另一方面，它也能誘導細胞發(fā)生自噬性死亡。但目前越來越多的研究表明抑制自噬可增強腫瘤治療的效果［4］。最近有文獻報道，粉防己堿可通過誘導胃癌細胞凋亡和自噬發(fā)揮抗腫瘤作用［5］；粉防己堿通過自噬依賴的Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝癌轉移［6］。然而，粉防己堿抑制卵巢癌細胞增殖是否與誘導自噬有關，目前鮮見報道。

因此，本研究通過體外觀察粉防己堿對人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3 細胞自噬的影響，以期為粉防己堿抗卵巢癌作用深入研究和臨床應用提供一定的參考和實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞株 人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3 細胞購自ATCC。

1.2 主要試劑 粉防己堿購自成都曼思特生物科技有限公司；MTT 購于碧云天生物有限公司；吖啶橙和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購自 Sig?ma-Aldrich；胎牛血清購自Gibco；胰蛋白酶和RPMI-1640 培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司；抗微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、P62、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR、AKT、p-AKT 和 GAPDH 抗體購自 Cell Signaling Tech?nology；ECL化學發(fā)光試劑購自上海碧云天生物有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) SKOV3 細胞用含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達80%時，進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

2.2 MTT 實驗檢測細胞活力 取對數(shù)期生長的細胞制備細胞懸液，以每孔5.0×103個細胞接種于96孔板中，將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24 h后細胞完全貼壁，加入0、2、4、8和16μmol/L的粉防己堿，每個濃度設置5個復孔，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL 濃度為2 g/L的MTT，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，將孔板中液體吸出，每孔加入DMSO 150 μL，使結晶物充分溶解。用酶標儀測定各孔波長490 nm 的吸光度（A），并計算細胞相對活力。實驗重復3次。

2.3 吖啶橙染色 將SKOV3細胞以5×107/L的密度接種于24孔板，每孔加入1 mL 細胞懸液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)過夜，24 h 后細胞完全貼壁，加入不同濃度的粉防己堿作用于SKOV3 細胞，將24孔板放培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去24孔板中的含藥培養(yǎng)液，PBS 輕輕清洗3 遍，用終濃度為1 mg/L 的吖啶橙溶液避光染色15 min，再用PBS 輕輕清洗染色后的SKOV3細胞，PBS 清洗3次，于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.4 Western blot 法檢測相關蛋白的水平 收集不同濃度的粉防己堿處理后的SKOV3 細胞，棄去含藥培養(yǎng)液，用預冷的PBS 洗滌，再用RIPA 細胞裂解液在冰上進行裂解，提取總蛋白。采用BCA 法測定各作用組蛋白濃度進行定量。按4∶1 加入loading buf?fer，將定量后的蛋白樣品在100℃下煮5 min 使蛋白變性；取等量的蛋白樣品（15μg）加入到配制好的丙烯酰胺凝膠泳道中電泳分離，然后將分離蛋白轉移至PVDF 膜上；用含5%牛血清白蛋白將膜封閉1 h，TBST清洗后，分別加入對應I抗（抗mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、LC3 和 P62 抗體均按 1∶1 000 稀釋，抗GAPDH 抗體按1∶2 000 稀釋），4℃孵育過夜；第2 天用TBST洗膜3次，每次5 min，再加入對應II抗（按1∶3 000 稀釋），室溫搖床孵育2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次5 min；將ECL發(fā)光液滴于PVDF 膜上，采用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光采圖，并用ImageJ 軟件進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結果用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較應用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 粉防己堿抑制SKOV3細胞活力

采用MTT 法檢測粉防己堿（0、2、4、8 和16 μmol/L）對SKOV3 細胞活力的影響，與對照（0 μmol/L）組相比，粉防己堿顯著抑制SKOV3 細胞的活力，且呈一定的劑量依賴性，作用24 h 其半數(shù)抑制濃度為15.21μmol/L，見圖1。

2 粉防己堿增加SKOV3細胞自噬溶酶體的產(chǎn)生

由于酸性的差異，吖啶橙染色使細胞中的自噬溶酶體顯示橘紅色熒光，而細胞核則顯示綠色熒光。吖啶橙染色結果顯示，采用粉防己堿干預SKOV3 細胞后，顯示橘紅色熒光的細胞增多，且細胞中橘紅色熒光的區(qū)域增大，其中以4和8μmol/L粉防己堿的作用較為明顯，說明粉防己堿增加了SKOV3 細胞中酸性自噬溶酶體的數(shù)量，見圖2。

Figure 1.The effect of different concentrations of tetrandrine for 24 h on the viability of SKOV3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖1 不同濃度粉防己堿作用24 h對SKOV3細胞活力的影響

3 粉防己堿誘導SKOV3細胞自噬

Western blot 結果顯示，粉防己堿干預SKOV3 細胞24 h 后，自噬標志蛋白LC3-Ⅱ的表達水平顯著升高，同時，P62 蛋白水平也顯著升高（P＜0.01），提示粉防己堿能夠促進SKOV3細胞自噬，見圖3。

Figure 2.Tetrandrine induced autophagosome accumulation in the SKOV3 cells（acridine orange staining，×400）.圖2 不同濃度粉防己堿對SKOV3細胞內自噬溶酶體形成的影響

4 抑制自噬增強粉防己堿對SKOV3細胞活力的抑制作用

為明確粉防己堿誘導的自噬與SKOV3 細胞活力的關系，將自噬抑制劑3-MA 與粉防己堿聯(lián)合作用SKOV3 細胞。粉防己堿（4 和8 μmol/L）與3-MA（5 mmol/L）單獨或聯(lián)合處理SKOV3 細胞 24 h 后，MTT結果顯示，與單獨粉防己堿處理組相比，粉防己堿聯(lián)合3-MA 處理組SKOV3 細胞的活力顯著降低（P＜0.01），說明 3-MA 增強了粉防己堿對 SKOV3 細胞活力的抑制作用，見圖4。

5 粉防己堿抑制SKOV3 細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路

Western blot 結果顯示，用粉防己堿干預SKOV3細胞24 h 后，與對照（0 μmol/L）組相比，粉防己堿能明顯降低p-mTOR 和p-AKT 蛋白的水平（P＜0.01），然而粉防己堿對mTOR 和AKT 總蛋白的水平無明顯影響，見圖5。

Figure 3.The protein levels of LC3-Ⅱand P62 in the SKOV3 cells treated with tetrandrine.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖3 粉防己堿對SKOV3細胞LC3和P62蛋白表達的影響

Figure 4.Autophagy inhibitor 3-methyladenine （3-MA） en?hanced the inhibitory effect of tetrandrine（TET）on the viability of SKOV3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 μmol/L TET group；##P＜0.01 vs 4 μmol/L TET group；△△P＜0.01 vs 8 μmol/L TET group.圖4 自噬抑制劑增強粉防己堿對SKOV3 細胞活力的抑制作用

討 論

卵巢癌是目前全球危害女性健康常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率持續(xù)上升，并且年輕化趨勢越來越明顯。粉防己堿是從中藥粉防己的塊根中提取到的一種雙芐基喹啉生物堿，已被廣泛應用于中醫(yī)臨床治療高血壓和心律失常等［7］?，F(xiàn)在越來越多的研究顯示粉防己堿可通過誘導自噬在治療腫瘤方面有潛在的療效。Guo 等［8］報道粉防己堿通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路誘導乳腺癌MDA-MB-231 細胞自噬，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Huang 等［9］研究顯示粉防己堿誘導口腔癌細胞發(fā)生自噬性細胞死亡。然而粉防己堿誘導自噬對卵巢癌細胞增殖的影響，目前研究尚少。

我們通過吖啶橙染色及Western blot 法檢測自噬相關指標，發(fā)現(xiàn)粉防己堿可誘導SKOV3 細胞發(fā)生自噬。自噬是在應激條件下參與細胞穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝過程，其功能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽略的作用。大量研究表明，自噬在腫瘤細胞中具有雙重作用，一方面，它能起到保護細胞的作用；另一方面，它也能誘導細胞發(fā)生自噬性死亡［10］。但最近越來越多的研究表明抑制自噬可增強腫瘤治療的效果。為了明確粉防己堿誘導的自噬是保護細胞的作用還是導致自噬性的細胞死亡，本研究使用了粉防己堿與自噬抑制劑3-MA 聯(lián)合用藥，觀察SKOV3細胞活力的變化。結果顯示，與單獨加入粉防己堿相比，同時加入自噬抑制劑3-MA 和粉防己堿更能顯著抑制SKOV3 細胞活力。這說明抑制細胞自噬并不能逆轉粉防己堿對SKOV3 細胞的殺傷作用，反而增強了對細胞的抑制作用。

Figure 5.The protein levels of p-mTOR，mTOR，p-AKT and AKT in the SKOV3 cells treated with tetrandrine.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖5 粉防己堿對SKOV3細胞p-mTOR、mTOR、p-AKT和AKT蛋白水平的影響

自噬受多條信號通路調控，PI3K/AKT/mTOR 信號通路是調節(jié)自噬的重要信號通路之一。當細胞受到刺激后，PI3K 被激活，然后通過使AKT 磷酸化，進而激活下游的mTOR 等信號分子，發(fā)揮相應的生物學效應，其核心蛋白mTOR 是決定自噬體形成和成熟的關鍵蛋白［11-12］。抑制 mTOR 的功能，使 PI3K/AKT/mTOR 通路失活，則可以誘導自噬［13-14］。為了進一步明確粉防己堿誘導SKOV3 細胞發(fā)生自噬的分子機制，我們采用Western blot 檢測了PI3K/AKT/mTOR 信號通路中的關鍵蛋白mTOR、p-mTOR、AKT和p-AKT 水平的變化。結果顯示，與對照組相比，粉防己堿能顯著降低SKOV3 細胞中p-mTOR 和p-AKT的蛋白水平，而mTOR 和AKT 總蛋白水平變化不大，說明粉防己堿抑制了SKOV3 細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的活化。

綜上所述，粉防己堿可通過誘導人卵巢漿液性囊腺癌SKOV3 細胞自噬，促進細胞自噬性死亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，其分子機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的活化有關。本研究為粉防己堿應用于卵巢癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。