陳春蘭，張運(yùn)君，許和平，鄭少顏

（海南省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南海口570100）

血管瘤是嬰幼兒最常見(jiàn)的血管源性皮膚腫瘤，具有迅速增殖后自發(fā)消退的特性［1］。大多數(shù)血管瘤是良性的，不對(duì)嬰兒構(gòu)成嚴(yán)重威脅或產(chǎn)生并發(fā)癥，但是，少量血管瘤的高速生長(zhǎng)或侵襲，可導(dǎo)致組織或器官損傷，并在某些情況下威脅生命［2］。目前，血管瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的非控性增生是引發(fā)血管瘤的重要因素［3］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與血管新生等作用，被認(rèn)為與血管瘤有著重要的聯(lián)系［4-5］。藁本內(nèi)酯（ligustilide）又名3-丁烯基-4，5-二氫-1（3H）-異苯并呋喃酮，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥傘形科植物當(dāng)歸揮發(fā)油的主要活性成分。研究顯示，藁本內(nèi)酯在舒張血管、抗血小板凝聚、抗炎等方面有生物學(xué)活性作用，同時(shí)藁本內(nèi)酯對(duì)乳腺癌、肺癌等腫瘤具有抑制作用［6-8］。雖然尚未見(jiàn)到藁本內(nèi)酯作用于血管瘤的研究及機(jī)制的報(bào)道，但可根據(jù)上述研究預(yù)測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)其可能具有抑制作用。本研究旨在探討藁本內(nèi)酯對(duì)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（human hemangioendothelial cells，HemECs）增殖與血管新生的影響，并分析其機(jī)制。

材料和方法

1 材料和試劑

HemECs 購(gòu)自上海澤葉生物公司。用EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞融合率達(dá)到85%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。藁本內(nèi)酯購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；EGM-2MV培養(yǎng)基購(gòu)自Lonza；Matrigel 購(gòu)自BD；EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博公司；TRIzol 試劑盒購(gòu)自Invitro?gen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega；CCK-8 試劑盒和RIPA 細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物研究所；抗VEGF、E-cadherin、vimentin 和 β-catenin 抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗購(gòu)自Abcam；Lipfectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher。

2 儀器

酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Fisher；熒光顯微鏡購(gòu)自Nikon；電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自Bio-Rad；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 按CCK-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，于96 孔板中，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，每組3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h；將12個(gè)濃度梯度（0、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100、200、300 和400 μmol/L）的藁本內(nèi)酯，分別加入對(duì)應(yīng)的12 組孔中，37℃孵育24 h；每孔加入10μL的CCK-8試劑，37℃孵育1 h；酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.2 EdU 染色實(shí)驗(yàn) 按照細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，于24 孔板中每孔接種3×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng) 24 h；加入 0、10、25 和 50 μmol/L 的藁本內(nèi)酯處理細(xì)胞；再經(jīng)過(guò)血清剝奪，培養(yǎng)48 h；加入20μmol/L EdU 工作液，孵育2 h；加入4%多聚甲醛，并固定15 min；加入200 μL click 反應(yīng)液避光孵育30 min；使用Hoechst 33342染料進(jìn)行細(xì)胞核染色；熒光顯微鏡，鏡下觀察；使用ImageJ 軟件計(jì)算EdU 陽(yáng)性細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3 微管形成實(shí)驗(yàn) 提前用不同濃度（0、10、25、50μmol/L）的藁本內(nèi)酯處理HemECs細(xì)胞；將Matrigel與4℃預(yù)冷的無(wú)血清EGM-2MV 培養(yǎng)基按1：1 比例混合后平鋪于24 孔板的孔底，每孔300μL，孵育30 min；取先前處理的細(xì)胞1.2×108/L 后接種于上述在鋪好膠的 24 孔板中，每孔 1 mL，孵育 16 h，每隔 4 h 觀察微管樣結(jié)構(gòu)形成情況，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野拍照；采用Microvision Saisam 軟件分析圖像，并對(duì)微管樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4 Western blot 檢測(cè)VEGF 及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá) 用0、10、25和50μmol/L濃度的藁本內(nèi)酯處理 HemECs 于 6 孔板中培養(yǎng) 48 h；使用 RIPA 裂解液將先前處理的細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取總蛋白；使用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度；10% SDS-PAGE 分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜；用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白1 h，隨后加入Ⅰ抗（VEGF、E-cad?herin、vimentin和β-catenin抗體稀釋度均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（稀釋度為1∶1 000），室溫孵育2 h；按照同樣的方法與β-actin抗體孵育；ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色。

3.5 鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化 用不同濃度（0、10、25 和 50 μmol/L）的藁本內(nèi)酯處理 HemECs 于6 孔板中培養(yǎng)48 h；光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野拍照；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于倒置顯微鏡下培養(yǎng)，觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

3.6 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，設(shè)立未轉(zhuǎn)染組（無(wú)特殊處理）、空載體組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 載體）和VEGF 轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VEGF165 質(zhì)粒）。采用Lip?fectamine 2000 轉(zhuǎn)染，4 h 后更換正常培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

3.7 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF的mRNA表達(dá) 按照TRIzol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA；根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃ 10 s、60℃ 20 s、70℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參照。VEGF 上游引物序列為5'-AT?GAACTTTCTGCTGTCTTGG-3'，下游引物序列為5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3'；β-actin 上游引物序列為5'-ATCTGGCACCACACCTTCTA-3'，下游引物序列為5'-CTTCTTAATGTCACGCACGA-3'。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，并用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs活力的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，100～400μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組的細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），而 0.1～50 μmol/L 的藁本內(nèi)酯處理對(duì)細(xì)胞活力的影響并不明顯，故選擇藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs 無(wú)顯著毒性的濃度（10、25 和50 μmol/L）進(jìn)行后續(xù)的研究，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of ligustilide at different concentrations on the viability of HemECs.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖1 不同濃度的藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs活力的影響

2 EdU染色檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs增殖的影響

EdU 染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，25 和50μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組的EdU 陽(yáng)性（紅色熒光）細(xì)胞顯著減少（P＜0.05），即增殖的細(xì)胞顯著減少，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effect of ligustilide on the proliferation of HemECs detected by EdU staining（×200）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖2 EdU染色檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs增殖的影響

3 微管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs 血管新生的影響

微管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)照組中的微管樣結(jié)構(gòu)完整而典型，25 和50 μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組的微管樣結(jié)構(gòu)被破壞，斷斷續(xù)續(xù)、不完整，典型的微管樣結(jié)構(gòu)顯著減少；通過(guò)計(jì)數(shù)，25 和50μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組相較于對(duì)照組的微管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

4 Western blot 檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs中VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，25和50μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組VEGF蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

5 顯微鏡下觀察藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs 上皮-間充質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)換的影響

顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)顯示，對(duì)照組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞間連接松散；與對(duì)照組相比，25和50μmol/L藁本內(nèi)酯處理組的細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞密集，細(xì)胞間隙小，見(jiàn)圖5。

Figure 3.The effect of ligustilide on angiogenesis of HemECs detected by microtubule formation experiment（×100）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖3 微管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs血管新生的影響

Figure 4.The effect of ligustilide on the protein expression of VEGF in HemECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs 0μmol/L group.圖4 藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 5.The effect of ligustilide on the morphological changes of epithelial-mesenchymal transition in HemECs was observed under microscope（×100）.圖5 顯微鏡觀察藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs上皮-間充質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)換的影響

6 Western blot 檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs 中EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，25和50μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組的E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），vimentin 蛋白和β-catenin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

7 蒿本內(nèi)酯對(duì)VEGF 過(guò)表達(dá)引起的血管新生和EMT的影響

RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）相比，VEGF 組的mRNA 表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖7A，說(shuō)明VEGF 過(guò)表達(dá)成功。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，VEGF 組的VEGF 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表白顯著下調(diào)（P＜0.05），vimentin 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）；與VEGF組相比，ligustilide+VEGF 組的VEGF蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），vimentin 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖7B。

討 論

Figure 6.The effect of ligustilide on the expression of epithelial-mesenchymal transition marker proteins in HemECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs 0μmol/L group.圖6 Western blot檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)HemECs中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

血管瘤是一種常見(jiàn)的嬰幼兒良性腫瘤，具有獨(dú)特的演變周期，包括增生期與消退期。大多數(shù)血管瘤未經(jīng)治療可自行消退，但是少數(shù)血管瘤會(huì)干擾視力、呼吸，甚至導(dǎo)致組織或器官損傷，并在某些情況下威脅生命。雖然發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但與血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞異常增生密切相關(guān)。藁本內(nèi)酯是苯酞類(lèi)化合物的典型代表，具有抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、改善微循環(huán)和抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用［9］，其中藁本內(nèi)酯的抗腫瘤作用越來(lái)越受到關(guān)注。

研究表明，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞異常增生，病理特征表現(xiàn)為局部雜亂無(wú)章的血管過(guò)度增生及異常增生的內(nèi)皮細(xì)胞。在血管瘤的治療方法中，抑制血管瘤內(nèi)皮增生是一個(gè)重要的途徑，血管瘤的治療藥物普萘洛爾可以通過(guò)抑制血管瘤內(nèi)皮胞的增生，并促進(jìn)其凋亡，達(dá)到治療的目的［10］。EdU 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，25和50 μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組的EdU 陽(yáng)性細(xì)胞顯著少于對(duì)照組，說(shuō)明藁本內(nèi)酯能夠抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

Figure 7.The effect of ligustilide（50 μmol/L）on VEGF overexpression-induced angiogenesis and epithelial-mesenchymal transition in HemECs.A：the mRNA level of VEGF was detected by RT-qPCR；B：the protein levels of VEGF，E-cadherin and vi?mentin were detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs VEGF group.圖7 蒿本內(nèi)酯對(duì)VEGF過(guò)表達(dá)引起的血管新生和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

腫瘤血管生成是指腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)毛細(xì)血管新生，為腫瘤的生長(zhǎng)提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。在微管形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中，與對(duì)照組相比，25 和 50 μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組微管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量顯著減少，說(shuō)明藁本內(nèi)酯抑制腫瘤細(xì)胞的血管新生。腫瘤血管形成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，受多種因子調(diào)節(jié)，是刺激因素和抑制因素失衡的結(jié)果。VEGF 是目前所知的誘導(dǎo)血管生成最重要的生長(zhǎng)因子，也是血管瘤治療中的重要靶點(diǎn)［11-13］，雷帕霉素治療血管瘤就是通過(guò)降低VEGF 水平，達(dá)到治療的目的［14］。25和50 μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組與對(duì)照組相比，VEGF 蛋白表達(dá)顯著下降，說(shuō)明藁松內(nèi)酯可以下調(diào)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF 的表達(dá)，同時(shí)提示藁本內(nèi)酯與VEGF 之間可能存在靶向關(guān)系。

EMT 是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換為具有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力的過(guò)程［15-16］。而血管瘤惡性化主要表現(xiàn)是血管瘤的高速生長(zhǎng)或侵襲。在EMT 的過(guò)程中，上皮細(xì)胞特征標(biāo)志物E-cad?herin［17］表達(dá)下調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin［18］和βcatenin［19］蛋白表達(dá)上調(diào)。通過(guò) Western blot 檢測(cè)，與對(duì)照組相比，25 和50 μmol/L 藁本內(nèi)酯處理組的E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，vimentin 和βcatenin 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，表明藁本內(nèi)酯具有抑制HemECs EMT的作用。

EMT 是一個(gè)由多種途徑共同調(diào)控的過(guò)程，已有研究表明 VEGF 與 EMT 過(guò)程密切相關(guān)［20-21］。本研究通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)VEGF的質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，VEGF能夠引起HemECs 的 E-caderin 蛋白表達(dá)下調(diào)和 vimentin 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)EMT；而藁本內(nèi)酯則能阻斷VEGF 過(guò)表達(dá)引起的EMT。

綜上所述，藁本內(nèi)酯能夠抑制HemECs 的增殖，并通過(guò)降低VEGF 水平抑制HemECs 的血管新生及EMT過(guò)程。