張小鷹，何金花，王 浩，郭明星，梁春燕

（廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院 1病理科，2檢驗(yàn)科，廣東廣州511400）

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。羽扇豆醇（lupeol）作為一類三萜化合物，廣泛存在于許多中草藥及食源性植物中，具有許多生物活性，包括抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用，在多種細(xì)胞株及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均顯示較強(qiáng)的抗腫瘤活性。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長度約18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子，與Argonaute（Ago）蛋白家族的成員直接相互作用后形成效應(yīng)復(fù)合物，介導(dǎo)靶向目標(biāo)的信使RNA（message RNA，mRNA）降解或翻譯抑制［1］。研究表明，miR-145-5p在胰腺癌、喉鱗癌、宮頸癌、前列腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察羽扇豆醇聯(lián)合miR-145-5p 對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探討其分子機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞與試劑

人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP 由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶（trypsin）-EDTA（Invitrogen）；RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone）；青霉素、鏈霉素和TUNEL 染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）；PBS、MTT 溶液和結(jié)晶紫染色液（Solarbio）；DAPI 染色液（HARVEY）；annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Tran?swell細(xì)胞培養(yǎng)板和Matrigel（BD）；專用爬片玻片（上海臥宏生物科技有限公司）；多聚甲醛（甘肅皓天化學(xué)科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 LNCaP 細(xì)胞用含10%小牛血清、青霉素（1×105U/L）和鏈霉素（100 mg/L）的RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度＞70%時(shí)，傾去培養(yǎng)液，用PBS 洗滌細(xì)胞。加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，37℃放置1～2 min 后再加入2 mL 含15%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。按每孔5×105細(xì)胞的濃度接種6 孔板，混勻后正常靜置培養(yǎng) 24 h。將 4 μg 的 miRNA 加至 250 μL的 OPTI-MEM 培 基 中 ，混 勻 。 將 10 μL 的 Lipo?fectamine 2000 加至另外 250 μL 的 OPTI-MEM 中，混勻，室溫靜置5 min。將miRNA 懸液和Lipofectamine 2000 懸液混合，總體積 500 μL，混勻，室溫靜置 20 min，將miRNA 和Lipofectamine 2000混合液加至6孔板的孔內(nèi)，混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后，細(xì)胞換液，每孔2 mL 培基。轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，收集細(xì)胞檢測(cè)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為7 組：（1）空白對(duì)照（cell）組：除培養(yǎng)基之外不加任何試劑；（2）陰性對(duì)照（negative control，NC）組 ：非 特 異 性 miRNA+Lipo?fectamine 2000 +轉(zhuǎn)染液；（3）溶劑（solvent）組：加入DMSO；（4）hsa-miR-145-5p 組；（5）lupeol 組：10μmol/L lupeol 處理；（6）hsa-miR-145-5p+lupeol 組；（7）NC+lupeol組。

2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 調(diào)節(jié)LNCaP 細(xì)胞密度至 1×107/L，接種于 96 孔培養(yǎng)板，每組設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔。分別每組加藥后，放置于37℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng) 24、48 和 72 h 后，每孔加 MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm 波長處測(cè)每孔的吸光度（A）。計(jì)算各組活力抑制率（%）=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組）×100%。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 調(diào)節(jié)LNCaP細(xì)胞密度至2×109/L，接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。分別每組加藥后，48 h 后，消化收集細(xì)胞，加入70%的乙醇固定，4℃孵育2 h，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，加入1 mL PI 染色液，4℃避光30 min。300 目尼龍網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA 含量，每個(gè)樣本隨機(jī)分析12 000個(gè)細(xì)胞，得各組細(xì)胞亞二倍體率和細(xì)胞生長周期比例，F(xiàn)ACSort CellQuest軟件（BD）分析處理結(jié)果。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 LNCaP 細(xì)胞，調(diào)節(jié)密度至2×106/L，接種于12孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。分別每組加藥后，48 h 后，消化收集細(xì)胞，PBS 洗滌 3 次，吸盡上清，加入 200 μL 試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞后，分別加入10 μL an?nexin V-FITC 和 5 μL PI，混勻，4℃避光 30 min，再加入 300 μL 結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測(cè) annexin V-FITC 陽性和PI 陰性的細(xì)胞群（即LR 細(xì)胞群）為早期凋亡細(xì)胞群。

2.5 TUNEL 實(shí)驗(yàn) 將專用爬片置于濃硫酸中浸泡過夜，用三蒸水沖洗，高壓滅菌放入6孔板中，48 h后取出玻片，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗5 遍，加入含0.1% Triton X-100 的PBS，冰浴孵育2 min。加入 50 μL TUNEL 檢測(cè)液，37℃避光孵育 60 min。在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。

2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 收集處理組細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，用100μL無血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的小室上室，在下室加入600μL 完全培養(yǎng)基。在37℃、5% CO2孵育24 h 后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌1次。用結(jié)晶紫染色的上室下表面細(xì)胞，可用33%醋酸洗脫，細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

2.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 4℃溶解Matrigel 過夜，用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基以1∶3 的體積比稀釋Matrigel，取40μL 加入預(yù)冷的 Transwell 小室中，37℃孵育 2 h 使Matrigel 凝固。吸走小室中多余的液體，并在上室、下室分別加入100μL 和600μL 無血清培養(yǎng)基，37℃平衡過夜。處理過的細(xì)胞計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，用100μL 無血清 DMEM 培養(yǎng)基重懸，加入 Transwell 小室上室，在下室加入600 μL 完全培養(yǎng)基。在37℃、5%CO2孵育24 和48 h 后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗滌1 次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌1次，細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

2.8 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，24 h 后用槍頭垂直于6 孔板長面劃痕，用PBS 洗去劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h拍照。

2.9 集落形成實(shí)驗(yàn) 消化收集各組的細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔接種密度是每孔500 個(gè)。接種完畢，各孔補(bǔ)加培養(yǎng)基至300 μL。水平位左右前后晃動(dòng)培養(yǎng)板，盡使孔內(nèi)細(xì)胞分布均勻。培養(yǎng)7 d 后，吸去各孔培養(yǎng)基，PBS漂洗2 次，各孔加200 μL 結(jié)晶紫染色液應(yīng)充分覆蓋孔底，20 min 后將孔板置于自來水下沖洗，晾干計(jì)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（one-way ANO?VA）分析組間差異的顯著性，SNK 法進(jìn)行事后多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞活力抑制率檢測(cè)

細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染后，用MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞24、48 和 72 h 的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，solvent 組與 NC 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），hsa-miR-145-5p 組、lupeol、hsa-miR-145-5p+lupeol 和 NC+lupeol 組出現(xiàn)了明顯的活力抑制作用，與NC 組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合用藥（hsa-miR-145-5p+lupeol）組與單獨(dú)用藥（hsa-miR-145-5p、lupeol 和NC+lupeol）組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥出現(xiàn)更有效的活力抑制作用，見圖1。

Figure 1.The viability-inhibitory effect of hsa-miR-145-5p and lupeol on LNCaP cells for 24，48 and 72 h.The cell viability was measured by CCK-8 assay.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs hsa-miR-145-5p+lupeol group.圖1 hsa-miR-145-5p和lupeol作用于LNCaP細(xì)胞24、48和72 h后細(xì)胞活力抑制率的變化

2 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布

NC組和solvent組的細(xì)胞周期比例與cell組細(xì)胞相似，而實(shí)驗(yàn)組（hsa-miR-145-5p、lupeol、hsa-miR-145-5p+lupeol 和 NC+lupeol 組）的 G0/G1期比例明顯上升，出現(xiàn)明顯G0/G1期阻滯，S 期和G2/M 期細(xì)胞減少，提示hsa-miR-145-5p 和lupeol 可能延緩了LNCaP細(xì)胞由G1期向S期的過渡，見圖2。

3 Annexin V/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞

Figure 2.The cell cycle distribution of LNCaP cells treated with hsa-miR-145-5p and lupeol for 48 h was determined with propidiuio?dide（PI）staining，and the percentage of hypodiploid cells was detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs cell group；#P＜0.05 vs hsa-miR-145-5p+lupeol group.圖2 hsa-miR-145-5p和lupeol對(duì)LNCaP細(xì)胞周期分布的影響

NC 組和solvent 組早期凋亡率分別為4.1%和4.3%，與cell組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；lupeol、hsa-miR-145-5p+lupeol 和 NC+lupeol 組出現(xiàn)了明顯的早期凋亡細(xì)胞群，與cell組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合用藥優(yōu)于單獨(dú)用藥，見圖3。這一結(jié)果提示lupeol 可抑制LNCaP 細(xì)胞活力，促進(jìn)其凋亡，聯(lián)合使用hsa-miR-145-5p和lupeol能更有效地抑制細(xì)胞活力。

4 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡細(xì)胞

LNCaP 細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光，兩者重疊后正常細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核呈深綠色熒光。與cell 組比較，lupeol、hsa-miR-145-5p+lupeol 和NC+lupeol 組出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞群，見圖4。

5 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

與cell組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)目明顯降低（P＜0.05），可見hsa-miR-145-5p 和lupeol 可抑制LNCaP 細(xì)胞的遷移和侵襲能力；與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合用藥可顯著降低LNCaP 細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P＜0.05），見圖5。

Figure 3.Early apoptosis of LNCaP cells treated with hsa-miR-145-5p and lupeol was detected by flow cytometry with annexin VFITC and PI double staining.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs cell group；#P＜0.05 vs hsa-miR-145-5p+lupeol group.圖3 hsa-miR-145-5p和lupeol對(duì)LNCaP早期細(xì)胞凋亡的影響

6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

實(shí)驗(yàn)組和細(xì)胞對(duì)照組劃線后在鏡下視野中可見一條細(xì)長等寬的無細(xì)胞劃痕區(qū)，48 h 后cell組、NC 組和solvent組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移基本上覆蓋了大部分劃痕區(qū)，而實(shí)驗(yàn)組的劃痕區(qū)依然明顯存在；NC 組和sol?vent 組的細(xì)胞遷移率與cell 組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞遷移率與cell 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合用藥（hsa-miR-145-5p+lupeol）組 與 單 獨(dú) 用 藥（hsa-miR-145-5p、lupeol 和NC+lupeol）組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 6。這表明 hsa-miR-145-5p 和 lupeol 能明顯抑制LNCaP 細(xì)胞的遷移，聯(lián)合用藥能更好得抑制細(xì)胞的遷移。

7 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與cell 組相比較，NC 組和solvent 組未見明顯差異，而實(shí)驗(yàn)組的集落數(shù)量明顯減少（P＜0.05），聯(lián)合使用 hsa-miR-145-5p 和 lupeol 對(duì) LNCaP 細(xì)胞產(chǎn)生明顯的集落形成抑制作用，抑制率高達(dá)79.77%，見圖7。

Figure 4.Apoptosis-inducing effect of hsa-miR-145-5p and lupeol on LNCaP cells detected by TUNEL experiment（×100）.Normal cell nuclei show blue fluorescence，apoptotic cell nuclei show green fluorescence.圖4 通過TUNEL實(shí)驗(yàn)觀察hsa-miR-145-5p和lupeol對(duì)LNCaP細(xì)胞凋亡的影響

討 論

前列腺癌已成為男性最常見的腫瘤，占全球腫瘤發(fā)病第5 位。中國是前列腺癌發(fā)病及死亡較低的國家之一，但在我國隨著老齡化人口的增多，前列腺癌的發(fā)病率在近年來呈現(xiàn)持續(xù)快速增長趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA 與前列腺的發(fā)生和發(fā)展有潛在的聯(lián)系。有學(xué)者［2］發(fā)現(xiàn) hsa-miR-145-5p 在前列腺組織中呈低表達(dá)，而在正常前列腺組織中呈高表達(dá)。因此，通過過表達(dá)hsa-miR-145-5p 在LNCaP 細(xì)胞中選擇性改變其表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測(cè)LNCaP細(xì)胞的活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡，并通過Tran?swell 法檢測(cè)LNCaP 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞對(duì)照組、非特異性對(duì)照組和溶劑組未出現(xiàn)有效的細(xì)胞活力抑制、遷移抑制和侵襲抑制，而hsa-miR-145-5p組出現(xiàn)顯著抑制腫瘤細(xì)胞活力、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)體外早期凋亡，提示hsa-miR-145-5p對(duì)LNCaP 細(xì)胞抑制作用具有特異性。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-145-5p 轉(zhuǎn)染LNCaP 細(xì)胞后，G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)減少，G2期細(xì)胞明顯減少，提示hsa-miR-145-5p 可能延緩了前列腺癌LNCaP 細(xì)胞由G1期向S 期的過渡。有研究采用TargetScan、miRanda、PicTar［3］軟件預(yù)測(cè) hsa-miR-145-5p 的靶基因，發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)潛在調(diào)控基因IRS1、OCT4、SOX2、KLF4、MYC和RTKN［4］。KEGG pathway 分析顯示靶基因顯著富集于p53 信號(hào)通路，ErbB 信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路，慢性骨髓白血病，膀胱癌，膠質(zhì)瘤，前列腺癌和胰腺癌等，進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-145-5p 與腫瘤的相關(guān)性，推測(cè)其可能通過調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)基因，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。hsa-miR-145-5p［5］的靶基因包括一些重要的腫瘤相關(guān)基因，主要有EGFR、TP53、SMAD4、KIT、JAK3、FBXW、GNAQ、ATM等，這些基因在諸多研究中證實(shí)與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，比如EGFR［6］是一種重要的跨膜受體，具有酪氨酸激酶活性，被激活后參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡，它與腫瘤的形成和惡化密切相關(guān)，尤其參與了非小細(xì)胞肺癌的形成。TP53［7］基因是重要的抑癌基因，TP53基因的突變導(dǎo)致很多腫瘤的發(fā)生，比如卵巢高級(jí)別漿液性癌、乳腺癌、尿路上皮癌等。高偉［8］通過 RT-qPCR 檢測(cè) miR-145-5p 在喉鱗癌的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-145-5p在喉鱗癌中顯著下調(diào)，扮演抑癌基因角色，而其靶基因FSCN1扮演癌基因角色。明確了miR-145-5p及靶基因FSCN1調(diào)控紊亂是喉癌中的重要分子事件。徐馳［9］提示miRNA-145 可以通過調(diào)控Klf4 和Oct4 來抑制A549 肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等能力。針對(duì)miRNA-145 調(diào)節(jié)靶基因Klf4和Oct4的信號(hào)通路，設(shè)計(jì)阻斷該通路信號(hào)傳導(dǎo)的肺癌基因治療和藥物治療策略，有可能為肺癌靶向治療提供新靶點(diǎn)。

Figure 5.The effects of hsa-miR-145-5p and lupeol on the migration（A）and invasion（B）abilities of LNCaP cells（crystal violet staining，×100）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs cell group；#P＜0.05 vs hsa-miR-145-5p+lupeol group.圖5 hsa-miR-145-5p和lupeol對(duì)LNCaP細(xì)胞遷移與侵襲的影響

狼毒大戟［10］作為中藥已廣泛應(yīng)用于臨床，其中有效成分lupeol 具有很好的抗腫瘤活性。既往研究表明lupeol 已被證實(shí)能夠抑制包括皮膚癌和胰腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制血管生成及負(fù)調(diào)控促癌信號(hào)通路，如Wnt和PI3K/AKT 等信號(hào)通路，并指出lupeol抑制蛋白激酶與色氨酸蛋白酶的作用，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其對(duì)前列腺癌的作用未見報(bào)道。因此本研究通過細(xì)胞增殖、遷移等方法觀察lupeol 對(duì)人前列腺癌LNCaP 細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，lupeol 對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞有明顯抑制增殖和誘導(dǎo)早期凋亡的作用。

近年來，中藥的活性成分對(duì)腫瘤相關(guān)miRNA 的調(diào)節(jié)研究取得一定的進(jìn)展［11］。比如羽扇豆醇［12］對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)MAPKs 信號(hào)通路相關(guān)調(diào)控蛋白的磷酸化有關(guān)。姜黃素［13］通過上調(diào)miR-22 來抑制miRNA-22 靶向基因SP1和ESR1的表達(dá)。藤黃酸［14］通過增強(qiáng)胃癌中miR-590-5p表達(dá)水平進(jìn)而抑制胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移，miR-590-5p 通過調(diào)控 TGF-β2 以及 Akt/mTOR 信號(hào)通過從而抑制胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移過程。黃芩素［15］可有效抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制與黃芩素調(diào)控p12-LOX、VEGF、p-ez?rin 及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)變化有關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)中l(wèi)upeol 對(duì)前列腺癌LNCaP 細(xì)胞相關(guān)的miRNA 的表達(dá)，以及相關(guān)miRNA 調(diào)節(jié)的靶向基因需要進(jìn)一步探索。

Figure 6.The effect of hsa-miR-145-5p and lupeol on the migration ability of LNCaP cells（wound healing assay，×50）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs cell group；#P＜0.05 vs hsa-miR-145-5p+lupeol group.圖6 hsa-miR-145-5p和lupeol對(duì)LNCaP細(xì)胞遷移能力的影響

Figure 7.The effect of hsa-miR-145-5p and lupeol on the colony formation of LNCaP cells. n=3.*P＜0.05 vs cell group；#P＜0.05 vs hsa-miR-145-5p+lupeol group.圖7 hsa-miR-145-5p和lupeol對(duì)LNCaP細(xì)胞集落形成的影響

前期的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥聯(lián)合非編碼RNA 運(yùn)用于抗腫瘤治療取得了一定的效果。He等［16］將 miR-203 聯(lián)合砒霜轉(zhuǎn)染至白血病 K562 細(xì)胞，K562細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的增殖抑制，提高了K562細(xì)胞對(duì)砒霜的敏感性，為白血病治療提供了新的依據(jù)。孫文洪等［17］將hsa-miR-204 聯(lián)合中藥苦參堿能有效抑制MOLT-4 細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，苦參堿能增強(qiáng)MOLT-4 對(duì)hsa-miR-204 的敏感性。實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥聯(lián)合非編碼RNA 可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)非編碼RNA 的敏感性。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合使用lupeol 和hsa-miR-145-5p 作用于LNCaP 細(xì)胞，證實(shí)聯(lián)合使用lupeol 和hsa-miR-145-5p 能更有效地抑制LNCaP 細(xì)胞增殖，且lupeol 可增強(qiáng)hsa-miR-145-5p 對(duì)LNCaP 細(xì)胞的抑增殖和促凋亡作用。而lupeol 和hsa-miR-145-5p 是否存在共同的信號(hào)通路或靶向基因需待進(jìn)一步研究。