涂曉萌，李蓮蓮，李 雪，羅祖強

（1溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院眼視光學和視覺科學國家重點實驗室，2溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科，浙江溫州325027）

干細胞是未分化的細胞群，能不斷增殖和自我更新［1-3］，其特性之一是存在靜息狀態(tài)。在哺乳動物中，無論骨髓、腸上皮或毛囊，靜息干細胞和活化干細胞均存在于相同的組織中，靜息干細胞作為儲備力量，在維持體內(nèi)平衡和組織再生中發(fā)揮重要作用［4-6］。因此，細胞靜息狀態(tài)的研究將有助于理解生理和病理情況下的組織再生，為組織修復等提供新的治療策略。

在包括小鼠和靈長類在內(nèi)的哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，干細胞能夠分化為神經(jīng)元、少突膠質細胞和星形膠質細胞［7-8］。干細胞移植對神經(jīng)退行性病變（帕金森病、脊髓損傷、中風）的治療目前為醫(yī)學界的研究熱點［9］。小鼠胚胎大腦皮質發(fā)育過程中，孕早期（胚胎10～13 d）的神經(jīng)干細胞主要處于增殖狀態(tài)；在孕中期（胚胎13～17 d），一部分干細胞通過對稱分裂，得到兩個相同的子細胞，另一部分通過不對稱分裂得到一個子細胞和一個定向分化的細胞，這是神經(jīng)元大量產(chǎn)生的階段［10］。出生后，哺乳動物神經(jīng)干細胞主要存在于海馬的顆粒下層和室管膜下區(qū)［11-12］。小鼠室管膜下區(qū)中，具有星形膠質細胞特性的膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陽性（GFAP+）的B 細胞屬于干細胞，具有自我復制功能，是出生后產(chǎn)生的膠質細胞和神經(jīng)元的來源［13］。此外，小鼠中GFAP+細胞既存在于活化的細胞［也表達表皮生長因子受體（epidermal growth fac?tor receptor，EGFR），即EGFR+］，也存在于靜息狀態(tài)的細胞中［14］。

小鼠成體神經(jīng)干細胞的分離為干細胞移植治療神經(jīng)退行性疾病奠定了部分理論基礎［14-16］。但是成體干細胞的分化潛能相對較低，胚胎時期的干細胞具有更強的增殖和定向誘導分化能力。然而目前對于胚胎時期神經(jīng)干細胞的靜息和活化狀態(tài)之間的區(qū)別還知之甚少。因此，本研究從小鼠孕中期的胚胎入手，尋求一種分離胚胎時期靜息和活化神經(jīng)干細胞的方法，并對兩類細胞進行鑒定，為有效治療神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病提供參考資料。

材料和方法

1 動物

15～16 周清潔級 ICR 小鼠 20 只（雄鼠 2 只，雌鼠18 只），體重約30～40 g，來自并繁殖于溫州醫(yī)科大學動物學實驗室，動物合格證號為SYXK（浙）2015-0009。小鼠繁育，主要通過當天晚上合籠，第2 天分籠的方式，見栓則記為胚胎0.5 d（embryonic day 0.5，E0.5）。所有操作都嚴格遵循溫州醫(yī)科大學實驗動物和動物實驗相關管理條例進行。

2 主要試劑

2.1 細胞培養(yǎng)試劑 胎牛血清、0.25% trypsin-EDTA、HBSS（Hank's balanced salt solution）、DMEM/F12 培養(yǎng)基和B27 添加劑購自Gibco；青、鏈霉素購自Sigma；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自R&D；碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自上海生工公司。

2.2 抗體及其他試劑 PAX6 抗體購自R&D；Ki67抗體購自Millipore；GFAP 抗體購自Abcam；Olig2 抗體 購 自 Millipore；Alexa Flour 488、Cy3 和 Normal Donkey Serum 購自 Jackson ImmunoResearch；牛血清白蛋白購自 Cell Signaling Technology；甘氨酸、L-賴氨酸和Triton X-100 購自Sigma；PBS 購自福州邁新生物技術有限公司；RNeasy Mini Kit 購自QIAGEN；Power SYBR?Green PCR Master Mix 購自 Life Tech?nologies；逆轉錄試劑盒購自天根公司；β-巰基乙醇購自碧云天公司；多聚甲醛購自上海凌峰化學試劑有限公司。

2.3 實驗儀器 FACSCalibu、rFACSAria、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、CountessTMAutomated Cell Counter（Invi?trogen）；激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss LSM 710），ABI 7500熒光定量 PCR 儀和PCR擴增儀（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 大腦皮層單細胞懸液制備 在體式顯微鏡下，冰上分離小鼠E14.5 胚胎的大腦皮質，剪碎，置于適量0.05%胰酶中，37℃水浴消化8～10 min；加入等量預熱的DMEM 全培，終止消化；157×g，室溫離心5 min；棄上清，加入適量的DMEM；吹打數(shù)次，制成單細胞懸液；用40μm 的篩過濾懸液，去掉沒有消化完全的組織。

3.2 流式細胞術 單細胞懸液轉移至進樣管內(nèi)，上機后，細胞會分為明顯的兩個細胞團，分別設門，收集細胞。分選的細胞后續(xù)提取RNA，收集管接口處安裝兩個裝有1 mL D-PBS 的15 mL 收集管；如果細胞用于培養(yǎng)，收集管接口處安裝兩個裝有1 mL 培養(yǎng)液的15 mL 收集管，且收集管提前一天用FBS 孵育。樣本制作、上機分選等過程需嚴格無菌技術操作。

3.3 RT-qPCR 取流式分選出的大、小細胞，利用RNeasy Mini Kit 試劑盒提取總RNA，再使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。從NCBI GenBank 中查找cDNA序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，由上海華津生物有限公司進行引物合成，具體引物序列見表 1。RT-qPCR 選用 ABI 7500 熒光定量 PCR 系統(tǒng)。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火延伸55 s，40 個循環(huán)。反應體系如下：上、下游引物各 1.25 μL，12.5 μL SYBR Green I Master，2μL cDNA，ddH2O補足25μL。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

3.4 細胞周期的檢測 收集流式分選出大小細胞，314×g離心 10 min，棄上清，預冷的 PBS 洗 2 次，棄上清，邊震蕩邊緩慢加入70%乙醇至充分混勻，4℃固定細胞12 h 以上。將經(jīng)過固定的細胞157×g離心5 min，重復2 次，棄上清，0.5 mL PBS 重懸細胞，加入PI 和 RNaseA 至終濃度 50 g/L 室溫放置 10 min；流式細胞儀上機檢測。

3.5 細胞培養(yǎng) 收集流式分選出的大、小細胞，以5×108/L 的密度接種到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液成分（體積比）：86.8%DMEM/F12 培養(yǎng)基，10%胎牛血清，2%B27，0.1% bFGF（20 μg/L），0.1% EGF（20 μg/L），1%青、鏈霉素。細胞置于5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

3.6 免疫熒光染色 收集流式分選出的大、小細胞，經(jīng)細胞甩片機制片后，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.3% Triton X-100 破膜 5 min，PBS 洗 2 遍后加入適量的封閉液；室溫孵育1 h；加入Ⅰ抗［PAX6 抗體（1∶200）和Ki67抗體（1∶300）］，37℃孵育1 h；PBS洗 3 遍后，加入 Alexa Flour 488 和 Cy3 熒光Ⅱ抗（1∶500），37℃避光孵育1 h；加入抗淬滅封片劑（含DA?PI）封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察照相。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，顯著性差異分析用SPSS 11.5 軟件進行t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 小鼠E14.5 大腦皮質經(jīng)流式細胞術分選為大、小兩團細胞

取小鼠E14.5 大腦皮質，消化成單細胞懸液后，通過流式細胞術進行分選，存在兩團體積大小顯著差異的細胞群，即大細胞（big cells，B-cells，R2）和小細胞（small cells，S-cells，R1），見圖1。

Figure 1.The distribution of the cells shown by flow cytometry.R1：small cells；R2：big cells.圖1 流式細胞分選術的細胞分布圖

2 大細胞主要為神經(jīng)干細胞，小細胞部分為神經(jīng)干細胞

免疫熒光染色顯示，大細胞組細胞Pax6 染色陽性，小細胞組也存在部分Pax6陽性細胞；統(tǒng)計分析表明，大細胞組Pax6陽性率超過90%，說明大細胞幾乎全部是神經(jīng)干細胞，而小細胞組Pax6 陽性率約為37%，說明部分小細胞為神經(jīng)干細胞，見圖2。

3 RT-qPCR 檢測大、小細胞團干細胞特異性標志基因的表達

如圖3 所示，兩組均表達干細胞特異性基因Pax6、Oct4、Sox2和Nanog，進一步說明大小細胞均有干細胞特性；小細胞組Pax6的mRNA 相對表達量比大細胞組高約60倍（P＜0.05），而Oct4、Sox2及Nanog的mRNA表達水平均顯著低于大細胞組（P＜0.05）。

4 大、小細胞增殖特性的檢測

如圖4 所示，大細胞組Pax6 陽性的細胞中，Ki67染色幾乎為陽性；而小細胞組Pax6 陽性的細胞中，Ki67陽性率幾乎為零。

5 大、小細胞的細胞周期及周期相關蛋白的檢測

如圖5A 所示，處于G0/G1期的大細胞比例為85.16%，G2/M 期為6.08%；處于G0/G1期的小細胞比例為92.92%，G2/M 期為0.00%。這說明大細胞處于增殖活躍狀態(tài)，而小細胞增殖幾乎停滯，處于靜息狀態(tài)。

Figure 2.Identification of neural stem cells by Pax6 immunofluorescence staining（scale bar=20 μm）.Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs B-cells.圖2 免疫熒光染色鑒定神經(jīng)干細胞

Figure 3.RT-qPCR was used to detect stem cell specific marker genes in big and small cell clusters.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs B-cells.圖3 大、小細胞團干細胞特異性標志基因的RT-qPCR 檢測結果

如圖5B 所示，小細胞組細胞周期相關蛋白cy?clin A 和cyclin B 的mRNA 相對表達量低于大細胞組，說明與大細胞組相比，小細胞組G2/M期處于相對抑制的狀態(tài)；而大、小細胞組cyclin E 的mRNA 相對表達量無顯著差異（P＞0.05）。

6 大、小細胞體外培養(yǎng)特性不同

如圖6A所示，第4天時，大細胞組出現(xiàn)了明顯的微球，而小細胞組出現(xiàn)微球較晚；培養(yǎng)相同的時間，大細胞組產(chǎn)生的微球數(shù)量顯著多于小細胞組（P＜0.05）。培養(yǎng)至第7 天時，可以看到大細胞組形成的微球體積大，折光性好，邊緣細胞界限清楚；小細胞組僅形成由幾十個細胞組成的微球，呈桑葚狀，體積小，見圖6B。

7 小細胞在體外可以被激活成具有大細胞活性的細胞

把分選出的細胞放在干細胞培養(yǎng)基中，8 d 后，將微球消化成單細胞，甩片免疫熒光，檢測小細胞能否轉變成具活化的細胞。免疫熒光染色結果顯示，Pax6 陽性的小細胞Ki67 染色也陽性，同具有活性的大細胞染色結果相同；統(tǒng)計顯示，小細胞組Pax6 和Ki67 的共染比例與大細胞組相近，都達到了80%以上，無顯著差異（P＞0.05），見圖7。

Figure 4.Detection of proliferation characteristics of big and small cells by immunofluorescence staining of Pax6，Ki67 and DAPI（scale bar=20μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs B-cells.圖4 免疫熒光染色檢測大、小細胞的增殖特性

討 論

神經(jīng)干細胞具有靜息和活化兩種狀態(tài)，對于神經(jīng)發(fā)育十分重要。Codega 等［14］研究表明，在成年小鼠中成功分離了靜息及活化干細胞。胚胎時期是大腦發(fā)育的關鍵時期，目前有關靜息狀態(tài)干細胞的報道相對較少［17］。本課題著手于胚胎時期的大腦皮質，利用流式細胞術成功分離了胚胎期靜息及活化的神經(jīng)干細胞，并通過免疫熒光和RT-qPCR 檢測特異性標記基因的表達，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，分析兩種不同狀態(tài)的干細胞的差別以及聯(lián)系，為胚胎神經(jīng)干細胞移植的研究提供了部分理論基礎。

E14.5腦皮質取材的操作一直在冰上快速進行，可減少細胞降解酶的降解作用，維持了細胞的原始活性。消化時，用0.05%的胰酶及不同口徑巴氏管輕柔吹懸，可減少細胞碎片，保證了流式細胞分選時細胞處于較好的狀態(tài)。

Figure 5.Detection of cell cycle（A）and cell cycle-related gene expression（B）in big and small cell groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs B-cells.圖5 大、小細胞組細胞周期及周期相關基因表達的檢測

Figure 6.Different characteristics of big and small cells cultured in vitro.A：number of neurospheres；B：representative images of neurospheres after 7 d of culture（scale bar=20 μm）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs S-cells.圖6 體外培養(yǎng)的大、小細胞具有不同特性

流式細胞術是目前分選細胞的重要方法，把準備好的單細胞懸液上機后，呈明顯不同的大、小兩團細胞。分選設門時，不收集兩團細胞之間界限不清楚的細胞，僅收集明顯聚集的地方，保證細胞間不相互參雜，增強了實驗的準確性。通過細胞大小來區(qū)分神經(jīng)干細胞的靜息和活化狀態(tài)，可以將成分復雜的干細胞進行初步分類和分離，借此研究兩類細胞的特性和差別，借此剖析干細胞移植的有效性是否與不同活化狀態(tài)的細胞有關。

Pax6［18-20］、Sox2［21］、Oct4和 Nanog［22］均為干細胞調(diào)控的重要轉錄因子，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著決定性作用。免疫熒光分析顯示：兩組細胞Pax6 染色均為陽性，說明其具有干細胞的特性。RT-qPCR 結果也進一步證實了兩組細胞為神經(jīng)干細胞。

兩團細胞之間存在何種差異？從Codega等［14］的研究中得到啟發(fā)，本研究檢測了增殖細胞的特異性標志基因。免疫熒光分析表明，大細胞組的Ki67［23］染色陽性，而小細胞組的Ki67 染色為陰性。統(tǒng)計分析顯示，大細胞組中Ki67 陽性率接近100%；而小細胞組中幾乎為0，說明兩種干細胞增殖狀態(tài)不同：大細胞較為活躍，小細胞相對靜止。

有研究表明，小鼠小腸上皮靜息狀態(tài)的細胞處于持續(xù)的G1期，也可能在不同于G1的細胞周期，比如非增殖的G0期［24］。Zetterberg 等［25］研究顯示，血清剝奪可以使小鼠Swiss 3T3細胞所有細胞周期相關蛋白質合成受抑制，但只在G1早期，細胞退出周期并進入靜息狀態(tài)［26］。本研究結果顯示，小細胞G0/G1期比例顯著高于大細胞組，而G2/M 期為0，且小細胞組cy?clin A 和cyclin B 的表達顯著低于大細胞組（P＜0.05），說明小細胞組增殖停滯。這些結果與Ki67免疫熒光結果相一致，進一步驗證了小細胞是靜息狀態(tài)的神經(jīng)干細胞，而大細胞為活化的神經(jīng)干細胞。

Figure 7.Small cells can be activated in vitro.Neurospheres were digested into single cells，and then were immunostained with the Pax6 and Ki67 antibody.Scale bar=20 μm.Mean±SD. n=3.圖7 小細胞在體外可以被激活

小鼠神經(jīng)微球是評估體外干細胞增殖潛能的常用方法［27］。Codega 等［14］對成年小鼠大腦干細胞的研究顯示，靜息的神經(jīng)干細胞幾乎不產(chǎn)生神經(jīng)微球或貼壁的集落，再生時也不會增加微球的形成率；反之，活化的干細胞易于形成神經(jīng)微球和集落。本研究的神經(jīng)微球結果表明：在同樣條件下，大細胞4 d就能成典型的微球，而小細胞8 d才能看到微球的形態(tài)。統(tǒng)計顯示，大細胞的細胞數(shù)明顯高于小細胞，進一步證實了小細胞的增殖能力較差。這也從另一個方面驗證了分離的兩種細胞分別是靜息和活化的神經(jīng)干細胞。

在無脊椎動物中，當營養(yǎng)不足時干細胞就會轉成靜息狀態(tài)［28］；在哺乳動物中，靜息干細胞受刺激后，能被激活并進入細胞周期［5］。為此，我們在體外培養(yǎng)兩種細胞后，觀察兩者的狀態(tài)變化，都長成神經(jīng)微球后，消化成單個細胞再進行免疫熒光檢測。Ki67 和Pax6 染色結果表明，小細胞具備與大細胞一樣的增殖特性，說明靜息狀態(tài)下的小細胞可以被激活，轉化成活化的大細胞。巢蛋白（nestin）是神經(jīng)干細胞的標志物，在后續(xù)的實驗中將驗證這一指標。此外，還可以在培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中加入10%的血清，去掉生長因子，觀察小細胞定向分化為神經(jīng)元的能力。由于細胞的調(diào)控機制復雜，目前尚不清楚小細胞具體是通過何種途徑被活化的，還需要進一步研究。

綜上所述，本研究利用流式細胞術分選出大小兩團細胞，成功從小鼠胚胎大腦皮質中分離出靜息和活化的干細胞。此方法通過簡單的操作，不用借助標志物即可將干細胞這一相對混雜的細胞體系分離出不同的細胞類型，為提高胚胎干細胞移植在治療退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的效率提供了參考資料。