馬曉嬌，承歐梅，校 歡，王 宸，陳 爽，蔣青松，邱紅梅△

（1重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶400016）

近年來(lái)，腦血管疾病發(fā)病率逐漸升高，已成為危害人類(lèi)健康的重大疾病之一，且其存活患者中約75%伴有功能障礙，給患者帶來(lái)巨大的痛苦［1］。腦缺血的表現(xiàn)有多種形式，如局灶性和彌漫性腦缺血、永久性和急性腦缺血等，其中急性腦缺血患者因腦血液灌注不足致神經(jīng)元損傷而導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙、癡呆甚至植物狀態(tài)等后遺癥，嚴(yán)重影響患者的生活水平［2］。因此，是否可以通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，增加新的神經(jīng)元以更好地恢復(fù)這些患者的腦功能一直是神經(jīng)學(xué)研究的重點(diǎn)。

神經(jīng)發(fā)生是產(chǎn)生新神經(jīng)元的過(guò)程，主要是指神經(jīng)干/祖細(xì)胞（neural stem/progenitor cells，NSC/NPC）增殖、分化為新的神經(jīng)元并整合入既有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的過(guò)程［3］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生一直是神經(jīng)科學(xué)界倍受關(guān)注的研究領(lǐng)域，最初認(rèn)為神經(jīng)發(fā)生僅存在于哺乳動(dòng)物的胚胎期，而成年哺乳類(lèi)動(dòng)物腦組織神經(jīng)元是發(fā)育成熟的終極細(xì)胞，不再進(jìn)行增生和分化［4］。然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)也同樣存在神經(jīng)發(fā)生。研究顯示腦缺血能夠促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生，對(duì)腦缺血后的組織重構(gòu)和功能恢復(fù)有積極作用［5］，但其機(jī)制目前尚未闡明。

產(chǎn)紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體（erythropoietin-pro?ducing hepatocellular receptor，Eph）是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受體家族，因最初來(lái)源于可分泌紅細(xì)胞生成素的人肝癌細(xì)胞系而得名［6］。Eph 及其配體ephrin可廣泛參與機(jī)體的發(fā)育過(guò)程，特別是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成［7］。越來(lái)越多的研究表明，EphB2 及其配體ephrin-B1 可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞和前體細(xì)胞增殖［8］，其下游通路上的關(guān)鍵因子微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein-2，MAP-2）則調(diào)控樹(shù)突棘的發(fā)生和成熟，促進(jìn)神經(jīng)元軸突和樹(shù)突的生成，激活突觸結(jié)構(gòu)和功能的重建［9］。新生神經(jīng)元整合至功能性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中需要絡(luò)絲蛋白（reelin）與EphB 跨膜蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，誘導(dǎo)受體聚集和神經(jīng)元中EphB 前向信號(hào)的激活，將細(xì)胞遷移至最終位置，并協(xié)調(diào)神經(jīng)元生長(zhǎng)和分枝及神經(jīng)元突觸接觸的形成［10］。而EphB 可以通過(guò)下游N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體激活途徑參與突觸可塑性及記憶形成過(guò)程［11］。因此，本項(xiàng)工作建立小鼠急性腦缺血模型，觀察急性腦缺血對(duì)小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞及認(rèn)知功能的影響，并探討其機(jī)制是否與激活reelin 調(diào)控下的EphB2/ephrin-B1/NMDA受體信號(hào)通路有關(guān)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性7～8周齡健康成年C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（24±2）g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（渝）2018-0003。手術(shù)前小鼠自由攝食和飲水，并將小鼠置于22～25℃、12 h光照和12 h黑暗環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將52只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組和模型（model）組，每組26 只，其中用于Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)6只，HE染色4只，5-溴-2'-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU）免疫熒光染色4 只，雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）免疫熒光染色4只，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)4只，Western blot實(shí)驗(yàn)4只。

2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

BrdU（純度99%）和Triton X-100購(gòu)自Sigma；大鼠抗BrdU 單克隆抗體和兔抗DCX 單克隆抗體均購(gòu)自Abcam；山羊血清購(gòu)自武漢博士德生物公司；DyLight 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；DyLight 549標(biāo)記山羊抗大鼠IgG購(gòu)自Abbkine；其他生化試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。水迷宮（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（ZEISS）；定量PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

3 方法

3.1 小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉（bilateral common ca?rotid artery occlusion，BCCAO）模型的制備 根據(jù)文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)方法［12-13］建立小鼠BCCAO 模型。小鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。記錄體重后用3.5%水合氯醛（350 mg/kg，腹腔注射）麻醉，75%乙醇消毒頸部皮膚后沿正中剪開(kāi)，暴露氣管，用玻璃分針從氣管兩側(cè)小心鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，避免碰到迷走神經(jīng)，動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min 后取下夾子縫合傷口，假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸部總動(dòng)脈不進(jìn)行夾閉。手術(shù)全程保持小鼠恒溫。

3.2 HE 染色 造模后7 d，每組隨機(jī)選取4 只小鼠心臟灌注后取腦，4%多聚甲醛固定后梯度乙醇脫水，石蠟包埋后于前囟3.3～4.5 mm 連續(xù)切片，片厚5 μm，用于HE 染色。顯微鏡下觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計(jì)算正常神經(jīng)元數(shù)目。

3.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)［14］造模后28 d，每組隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，水迷宮設(shè)備由圓柱形水箱和視頻采集分析系統(tǒng)組成，水箱里水溫保持在（25±2）℃之間，平均分為4 個(gè)象限，在水箱的4 個(gè)象限分別放置4 個(gè)視覺(jué)提示，以幫助小鼠定位放置在水面下1 cm 的圓形平臺(tái)，視頻采集分析系統(tǒng)記錄小鼠的游泳軌跡、平臺(tái)潛伏期等數(shù)據(jù)。該實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和探索實(shí)驗(yàn)，在前5 d 的定位航行實(shí)驗(yàn)中，每天進(jìn)行4 次實(shí)驗(yàn)，在每次實(shí)驗(yàn)期間，小鼠從不同象限的池壁中間面對(duì)池壁放入并給予60 s 來(lái)定位平臺(tái)，記錄其找到隱藏平臺(tái)的時(shí)間，如果在60 s 內(nèi)找不到平臺(tái)，則將小鼠輕輕引導(dǎo)至平臺(tái)，找到隱藏平臺(tái)的時(shí)間記為60 s；第6天的探索實(shí)驗(yàn)則移去圓形平臺(tái)，讓小鼠探索游泳60 s，記錄小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)。通過(guò)使用頂置相機(jī)和行為跟蹤軟件記錄小鼠的移動(dòng)。

3.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

3.4.1 BrdU 免疫熒光 各組小鼠在造模后9～13 d腹腔注射BrdU（50 mg/kg），每天1 次，持續(xù)4 d。造模后14 d，每組隨機(jī)選取4只小鼠，心臟灌注后取腦，蔗糖溶液梯度脫水后采用冰凍切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，片厚8μm，甲酰胺修復(fù)、鹽酸變性、硼酸中和、Triton X-100 破膜、山羊血清封閉后，加入抗BrdU 抗體（1∶200）過(guò)夜。晾片后于暗室內(nèi)加入Ⅱ抗（1∶200），DAPI甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察海馬齒狀回BrdU 陽(yáng)性表達(dá)并拍照。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

3.4.2 DCX 免疫熒光 造模后14 d，每組隨機(jī)選取4 只小鼠，心臟灌注后取腦，蔗糖溶液梯度脫水后采用冰凍切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，片厚8 μm，冷丙酮固定、檸檬酸修復(fù)、Triton X-100 破膜、山羊血清封閉后，加入抗DCX抗體（1∶200）過(guò)夜。晾片后于暗室內(nèi)加入Ⅱ抗（1∶200），DAPI 甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察海馬齒狀回DCX 陽(yáng)性表達(dá)并拍照。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

3.5 RT-qPCR 檢測(cè) mRNA 的表達(dá) 造模后 14 d 每組隨機(jī)選取4 只小鼠，采用Trizol 提取海馬組織總RNA，以β-actin為內(nèi)參照，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所有引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.6 Western blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá) 造模后14 d，每組隨機(jī)選取4 只小鼠，麻醉后迅速斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬保存于液氮中；提取蛋白后采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度；經(jīng)過(guò)SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜后，加Ⅰ抗（抗β-ac?tin、EphB2、ephrin-B1 和 MAP-2 抗體以 1∶2 000 稀釋?zhuān)?reelin 抗體以 1∶5 000 稀釋?zhuān)?NR2A 和 NR2B 抗體以1∶1 000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，再滴加Ⅱ抗（1∶2 000）室溫孵育2 h；顯影后用Image Lab 4.1進(jìn)行圖像分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 急性腦缺血損傷小鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變

HE 染色可見(jiàn)，sham 組小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元飽滿(mǎn)呈圓形，排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰；而model組神經(jīng)元不規(guī)則呈固縮狀態(tài)，排列紊亂，結(jié)構(gòu)不完整，神經(jīng)元數(shù)目與sham組相比顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The pathological changes of hippocampal CA1 region aftter acute cerebral ischemia were observed by HE stainig（scale bar=20 μm）and the count of hippocampal CA1 neurons was calculated.Normal cells are indicated by the black arrows，while abnormal cells are indicated by the red arrows.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs sham group.圖1 急性腦缺血后海馬CA1區(qū)病理改變

2 急性腦缺血損傷對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

造模28 d 后，在5 d 的定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練天數(shù)增加，小鼠找到平臺(tái)時(shí)間逐漸縮短，但與sham組相比，model組小鼠從第2天起找到平臺(tái)的時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與sham 組相比，model 組小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of actue cerebral ischemia on spatial learning and memory of the mice.A：the trajectories of the mice to find the hidden platform in Morris water maze test；B：the escape latency time to find the hidden platform；C：the frequency of crossing the platform.Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs sham group.圖2 急性腦缺血對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

3 BrdU免疫熒光染色結(jié)果

BrdU 免疫熒光染色結(jié)果顯示，急性腦缺血14 d后sham組小鼠海馬齒狀回僅有少量BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，model組陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

4 DCX免疫熒光染色結(jié)果

Figure 3.The BrdU（red）positive cells in mouse hippocampal dentate gyrus 14 d after ischemia（scale bar=100 μm）.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs sham group.圖3 急性腦缺血后海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)

DCX 免疫熒光染色結(jié)果顯示，急性腦缺血14 d后，sham 組小鼠海馬齒狀回可見(jiàn)少量DCX 蛋白，而model組DCX蛋白表達(dá)顯著增多（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Figure 4.The protein expression of DCX（green）in mouse hippocampal dentate gyrus 14 d after ischemia（scale bar=100 μm）.Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs sham group.圖4 急性腦缺血后海馬齒狀回DCX蛋白表達(dá)

5 急性腦缺血對(duì) EphB2、ephrin-B1、reelin、MAP-2、NR2A和NR2B mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與sham 相比，model 組EphB2、ephrin-B1、reelin、MAP-2、NR2A和NR2B的mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；在蛋白水平，與sham 相比，model 組 EphB2、ephrin-B1、reelin、MAP-2、NR2A 和 NR2B 表達(dá)亦均顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

討 論

近年來(lái)，急性腦血管疾病的發(fā)病率不斷增高，與心臟病和惡性腫瘤已構(gòu)成大多數(shù)國(guó)家三大最主要的致死疾病。目前認(rèn)為，腦缺血引起海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)型固縮凋亡從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，而認(rèn)知功能障礙的主要原因可能是缺乏足夠的新生神經(jīng)元以恢復(fù)腦功能。神經(jīng)發(fā)生是指在一定條件下的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和遷移，可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，參與學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)［15］。因此，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生是恢復(fù)腦缺血患者認(rèn)知功能的有效手段。本研究擬通過(guò)小鼠急性腦缺血模型研究?jī)?nèi)源性神經(jīng)發(fā)生及其可能機(jī)制，為恢復(fù)腦功能提供可能的作用靶點(diǎn)。

Figure 5.Effect of acute cerebral ischemia on the mRNA and protein expression of EphB2（A），ephrin-B1（B），reelin（C），MAP-2（D），NR2A（E）and NR2B（F）.Mean±SD. n=4. **P＜0.01 vs sham group.圖5 急性腦缺血對(duì)EphB2、ephrin-B1、reelin、MAP-2、NR2A和NR2B mRNA及蛋白表達(dá)的影響

我們的研究顯示，建立腦缺血模型7 d后HE染色顯示model組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元不規(guī)則，呈固縮狀態(tài)，排列紊亂，結(jié)構(gòu)不完整，數(shù)目明顯減少，提示海馬CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)型凋亡；第28 天水迷宮實(shí)驗(yàn)中，model組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能顯著下降，提示腦缺血模型成功建立。腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞在9～13 d為增殖高峰。BrdU是一種核苷酸類(lèi)似物，親和力大于核苷酸，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)“假冒”核苷酸插入DNA 鏈中，本實(shí)驗(yàn)在缺血后9～13 d 外源性注射BrdU以觀察神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況。DCX在腦生長(zhǎng)發(fā)育中至關(guān)重要，在神經(jīng)元分裂、成熟、遷移直至整合到顆粒細(xì)胞層中持續(xù)表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示，model 組小鼠海馬齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞增殖指標(biāo)Br?dU 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和DCX 陽(yáng)性蛋白表達(dá)均顯著增加，表明腦缺血后海馬區(qū)存在內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，神經(jīng)干細(xì)胞被激活以增殖，遷移并分化為成熟的神經(jīng)元，并整合到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中。而在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，model組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能卻顯著下降，這提示雖然腦缺血后小鼠存在內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，但由于腦缺血后機(jī)體自身增殖的細(xì)胞數(shù)目較少，且疾病過(guò)程本身也可能破壞和削弱神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和修復(fù)的能力［16］，因此機(jī)體自身內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)不足恢復(fù)神經(jīng)以及認(rèn)知功能。

成年海馬神經(jīng)發(fā)生由網(wǎng)狀多靶標(biāo)介導(dǎo)，其中，ree?lin是主要的監(jiān)管因子之一。reelin是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是神經(jīng)元遷移及調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物高級(jí)腦功能必不可少的蛋白。Eph/ephrin 也是神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖和分化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。已有報(bào)道稱(chēng)，reelin 可以直接與EphB 的胞外域相互作用，從而激活基因敲除小鼠的EphB2/ephrin-B1 通路功能［10］。這些發(fā)現(xiàn)表明，reelin與EphB2/ephrin-B1途徑之間的相互作用對(duì)神經(jīng)功能具有非常重要的作用。MAP-2 是一種細(xì)胞骨架磷蛋白，可以為細(xì)胞器分布到樹(shù)突中以及在神經(jīng)發(fā)生中定位信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)裝置提供基礎(chǔ)支架［9］，其作為一種靶蛋白也受到EphB的調(diào)節(jié)。下游關(guān)鍵因子NMDA受體同樣可以被激活，參與突觸可塑性和記憶的形成過(guò)程，從而發(fā)揮介導(dǎo)海馬神經(jīng)發(fā)生的作用。但是，這些因素與小鼠急性腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，缺血后EphB2、ephrin-B1、ree?lin、MAP-2 及 NMDA 受 體 亞 基 NR2A 和 NR2B 的mRNA 及蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)。這些結(jié)果提示，EphB2/ephrin-B1/NMDA 受體信號(hào)通路的激活在促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中可能具有重要調(diào)控作用。

綜上所述，本項(xiàng)工作探討了急性腦缺血對(duì)小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞及其認(rèn)知功能的影響，結(jié)果提示腦缺血后促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生可能是通過(guò)激活EphB2/eph?rin-B1/NMDA受體信號(hào)通路，從而促進(jìn)了海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖，但由于內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)不足以恢復(fù)神經(jīng)功能，所以并未顯著改善記憶和認(rèn)知障礙。