常永杰，周利曉

（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院眼科，河南鄭州450052）

近年來(lái)，糖尿病的發(fā)病率持續(xù)升高，并呈現(xiàn)年輕化的態(tài)勢(shì)。而糖尿病作為一種代謝性疾病，可引發(fā)諸多嚴(yán)重的并發(fā)癥，例如糖尿病足、糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）、中風(fēng)、脂肪肝及腎臟疾?。?-2］。其中DR 嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活品質(zhì)，臨床上的表現(xiàn)為黃斑水腫、視網(wǎng)膜新生血管和玻璃體出血等，患者如不及早干預(yù)治療，嚴(yán)重的可導(dǎo)致失明［3-4］。臨床上，針對(duì)DR 的治療主要有激光治療、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth fac?tor，VEGF）治療和皮質(zhì)類(lèi)固醇治療［5-6］。已有研究表明，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增生是DR 的一個(gè)重要特征，DR 的病理發(fā)展過(guò)程是多因素共同的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制還不是特別清楚，有待進(jìn)一步深入的研究［7］。斯鈣素2（stanniocalcin 2，STC2）是一種體內(nèi)廣泛表達(dá)的可分泌蛋白，近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)與多種疾病存在密切的聯(lián)系，主要集中在惡性腫瘤中，如肺癌、肝癌、乳腺癌等［8-9］。目前的一些研究表明，STC2在糖尿病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮潛在的功能，但關(guān)于其在DR 中的表達(dá)尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。本研究從糖尿病大鼠模型入手，檢測(cè)STC2 在DR大鼠玻璃體中的表達(dá)，分析其與VEGF的聯(lián)系，并在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中探討STC2和VEGF表達(dá)上的調(diào)控關(guān)系，對(duì)于深入分析STC2 在DR 中的作用具有一定的啟發(fā)意義。

材料和方法

1 主要試劑

B27 無(wú)血清培養(yǎng)基和培養(yǎng)細(xì)胞用雙抗購(gòu)自Gib?co；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和蛋白marker 購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 細(xì)胞裂解液和預(yù)制SDS-PAGE 膠購(gòu)買(mǎi)于碧云天生物科技有限公司；STC2 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技公司；VEGFA ELISA 試劑盒購(gòu)自Abcam；VEGFA和STC2重組蛋白均購(gòu)自北京義翹神州公司；抗STC2抗體和Protein A/G 瓊脂糖珠購(gòu)自Santa Cruz；抗VEGF 抗體、羊抗鼠II 抗、羊抗兔II 抗和用于免疫共沉淀的IgG均購(gòu)自Proteintech。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證編號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，隨機(jī)分為正常對(duì)照（control）組和DR 組，每組12 只，糖尿病模型通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）進(jìn)行構(gòu)建，STZ使用0.1 mmol/L的檸檬酸鈉溶液配制。腹腔注射2 d 后，尾靜脈取血測(cè)定血糖濃度，血糖濃度高于20 mmol/L 認(rèn)為糖尿病模型構(gòu)建成功。糖尿病模型組每周腹腔注射STZ 2 次，維持4 周，然后繼續(xù)觀察至第8 周，每?jī)芍軠y(cè)定一次血糖。DR 模型構(gòu)建成功的標(biāo)志是大鼠眼睛晶體混濁，并伴有活動(dòng)遲緩、毛發(fā)變黃等情況［10］。大鼠血糖水平采用葡萄糖氧化酶法，使用的設(shè)備是羅氏的血糖儀及對(duì)應(yīng)試紙。

3 主要方法

3.1 大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞購(gòu)于普諾賽生物技術(shù)公司，培養(yǎng)于大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞完全培養(yǎng)基，添加B-27 和細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)雙抗，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞傳代使用胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合消化法，傳代不超過(guò)5次。

3.2 RT-qPCR 大鼠玻璃體組織經(jīng)勻漿后，加入RNA 提取試劑，室溫反應(yīng)10 min，加入相同體積氯仿，劇烈振蕩30 s 后靜置5 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入相同體積預(yù)冷的異丙醇溶液，混勻后靜置5 min，12 000 r/min 離心10 min，小心棄去上清，75%乙醇洗滌白色沉淀2次，得到的白色沉淀即為總RNA。風(fēng)干后加入經(jīng)DEPC 預(yù)處理的去離子水，使用翊圣的反轉(zhuǎn)錄試劑盒預(yù)處理RNA，去除可能殘余的基因組DNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成第1 鏈cDNA。使用翊圣的SYBR熒光定量PCR 試劑盒配制反應(yīng)體系，熔解曲線確定引物特異性，2-ΔΔCt法分析 STC2 和 VEGF mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。STC2 的正向引物序列為5'-CTGGGC?CAGTTTGTGACCC-3'，反向引物序列為5'-ACG TCATGCAAATCCCATGTAAA-3'；VEGF 的正向引物序列為5'-GCTACTGCCGTCCGATTGAG-3'，反向引物序列為5'-ACTCCAGGGCTTCATCGTTACAG-3'；內(nèi)參照β-actin 的正向引物序列為5'-GTGACGTTGA?CATCCGTAAAGA-3'，反向引物序列為5'-GCCG?GACTCATCGTACTCC-3'。

3.3 Western blot 實(shí)驗(yàn) 在大鼠玻璃體組織中加入RIPA 裂解液，經(jīng)超聲破碎后，12 000 r/min 離心，去除沉淀，濃縮蛋白裂解液，經(jīng)SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 洗滌2 次后，4℃過(guò)夜孵育I 抗，TBST 洗滌3 次，室溫孵育 II 抗 1 h，TBST 洗滌 3 次后，經(jīng) ECL 顯影。采用Quantity One軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)量的半定量分析。

3.4 ELISA實(shí)驗(yàn) 大鼠玻璃體組織經(jīng)PBS反復(fù)潤(rùn)洗后，收集潤(rùn)洗液，冷凍濃縮，濃縮液加入預(yù)包被好的STC2和VEGFA試劑盒中，37℃反應(yīng)1 h；加入生物素標(biāo)記的抗體工作液，反應(yīng)30 min；棄去液體，甩干，加入生物素標(biāo)記的抗體，37℃反應(yīng)1 h；棄去液體，甩干，洗板3 次，加入鏈親和素-辣根過(guò)氧化物酶工作液，37℃反應(yīng)30 min；棄去液體，洗板3 次，加入四甲基聯(lián)苯胺溶液，37℃反應(yīng)15 min；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品孔呈現(xiàn)明顯梯度，加終止液，450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

3.5 VEGFA或STC2蛋白處理大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 將大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng) 24 h 后，用 100 μg/L 的 VEGFA 或 STC2 蛋白處理細(xì)胞。孵育24 h 后，回收培養(yǎng)上清液，用ELISA 測(cè)定其中STC2 和VEGFA 的水平；細(xì)胞刮取后，經(jīng)預(yù)冷的PBS 洗滌 2 次，用 RT-qPCR 和 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中STC2和VEGF的表達(dá)水平。

3.6 免疫共沉淀驗(yàn)證VEGF 與STC2 的相互作用將大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞接種于15 cm 培養(yǎng)皿中，VEGFA 蛋白預(yù)處理 6 h；刮取細(xì)胞，PBS 洗 2 次，加入1 mL 低強(qiáng)度RIPA 裂解液冰上裂解1 h；離心取上清液，加入Protein A/G 瓊脂糖珠，于4℃冰箱中旋轉(zhuǎn)孵育1 h；然后等分到兩個(gè)離心管中，分別加入IgG 和抗VEGF 抗體（1∶100 稀釋?zhuān)?℃冰箱中繼續(xù)孵育12 h；然后 500×g離心，收集瓊脂糖珠，低強(qiáng)度 RIPA 裂解液輕輕洗滌2次，收集瓊脂糖珠；加入RIPA裂解液和蛋白上樣溶液，99℃加熱10 min；離心取上清，去除瓊脂糖珠，后續(xù)步驟同常規(guī)Western blot。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0 軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用Student'st檢驗(yàn)。兩變量的相關(guān)性采用Pearson分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DR大鼠玻璃體中STC2的表達(dá)升高

分別在第2、4、6 和8 周檢測(cè)對(duì)照組和模型組動(dòng)物血糖，模型組動(dòng)物血糖均超過(guò)20 mmol/L，見(jiàn)表1。這表明STZ 注射的糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。糖尿病模型維持8 周后，大鼠眼球出現(xiàn)晶體狀混濁現(xiàn)象，則認(rèn)為DR 模型構(gòu)建成功。RT-PCR 和Western blot結(jié)果顯示，DR 組中STC2 的mRNA 和蛋白水平較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖 1A～C。鑒于STC2 屬于分泌型蛋白，進(jìn)一步通過(guò)ELISA 測(cè)定大鼠玻璃體潤(rùn)洗液中STC2的蛋白含量，結(jié)果顯示，DR組分泌的STC2 蛋白水平也顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖1D。

表1 不同時(shí)點(diǎn)糖尿病模型和對(duì)照組大鼠血糖水平的比較Table 1.The blood glucose concentration in diabetic model and control rats at different time points（mmol/L.Mean±SD. n=12）

Figure 1.The expression level of STC2 was increased in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy（DR）.A：the mRNA level of STC2 was detected by RT-qPCR；B：Western blot was used to test the protein expression of STC2；C：the relative protein level was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of STC2 was tested by ELISA.Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.圖1 DR大鼠玻璃體中STC2的表達(dá)升高

2 VEGF在DR大鼠玻璃體中表達(dá)升高

相對(duì)于正常對(duì)照組，DR 組中 VEGF 的 mRNA 和蛋白水平明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2A～C。進(jìn)一步通過(guò)ELISA 檢測(cè)VEGF 信號(hào)通路關(guān)鍵的VEGFA 的分泌水平，結(jié)果顯示，DR組大鼠玻璃體VEGFA 蛋白分泌水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖2D。

Figure 2.The expression level of VEGF was increased in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy（DR）.A：the mRNA level of VEGF was detected by RT-qPCR；B：Western blot was used to test the protein expression of VEGF；C：the relative protein level of VEGF was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of VEGFA was tested by ELISA.Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.圖2 DR大鼠玻璃體中VEGF的表達(dá)升高

3 STC2與VEGF的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系

通過(guò)分析STC2 與VEGF 表達(dá)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在mRNA 水平上，STC2 與 VEGF 的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.96，P＜0.01），而在蛋白水平，分泌的STC2蛋白與VEGFA 蛋白也存在較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系（r=0.78，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

Figure 3.The correlation analysis between STC2 and VEGF expression levels in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy.A：the correlation between VEGF and STC2 mRNA levels；B：the correlation between VEGFA and STC2 secretion levels.圖3 DR大鼠玻璃體中STC2與VEGF表達(dá)水平的相關(guān)性分析

4 VEGFA 在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中誘導(dǎo)STC2表達(dá)，并促進(jìn)其分泌

為了進(jìn)一步探討STC2 和VEGF 的關(guān)系，我們用VEGFA 處理大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，24 h 后檢測(cè)STC2 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，VEGFA 處理能夠促進(jìn)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中STC2 的mRNA 和蛋白水平升高（P＜0.01），見(jiàn)圖4A～C。同時(shí)通過(guò)ELISA 考察VEGFA 處理對(duì)于STC2 分泌水平的影響，結(jié)果顯示，VEGFA 也能夠誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分泌大量STC2蛋白（P＜0.01），見(jiàn)圖4D。

Figure 4.VEGFA induced STC2 expression and promoted its secretion in rat retinal ganglion cells.A：the mRNA level of STC2 was examined by RT-qPCR；B：the protein level of STC2 was tested by Western blot；C：the relative protein level of STC2 was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of STC2 was examined by ELISA.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs PBS group.圖4 VEGFA誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中STC2的表達(dá)并促進(jìn)其分泌

5 STC2 蛋白促進(jìn)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中VEGF的表達(dá)

為了觀察STC2 對(duì)于VEGF 信號(hào)通路的關(guān)系，我們進(jìn)一步分析STC2 對(duì)VEGF 的反饋調(diào)節(jié)。用STC2蛋白孵育大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，24 h 后檢測(cè)VEGF的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，STC2蛋白能夠誘導(dǎo)VEGF 的表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖5A～C。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STC2蛋白也能夠促進(jìn)VEGFA的分泌，見(jiàn)圖5D。

6 STC2與VEGF存在相互作用

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用VEGF 抗體可以免疫沉淀出STC2蛋白，說(shuō)明STC2與VEGF 之間存在緊密的相互作用，見(jiàn)圖6。

討 論

本研究從構(gòu)建DR 大鼠模型入手，分析DR 大鼠玻璃體中STC2 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)STC2 在DR 大鼠玻璃體中的mRNA 和蛋白水平都顯著上升。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，VEGFA 不僅能夠上調(diào)STC2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，也能夠促進(jìn)STC2的分泌。STC2是一種糖蛋白，最初的研究表明STC2在調(diào)控鈣磷平衡方面發(fā)揮重要的功能［11］。STC2 在體內(nèi)廣泛表達(dá)，近年來(lái)其在惡性腫瘤中的研究越來(lái)越廣泛，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的預(yù)后存在緊密的聯(lián)系［12］。同時(shí)，也有越來(lái)越多的證據(jù)顯示，STC2在代謝性疾病中也發(fā)揮重要的功能。在高脂飲食和瘦素基因敲除2 種脂肪肝模型中，肝臟中的STC2 表達(dá)顯著下降［13］；陶文玉等［14］的研究也發(fā)現(xiàn)在 STZ 誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠肝臟中STC2 的表達(dá)也顯著上升，并且 STC2 可以激活 STAT3 和 NF-κB 信號(hào)通路，介導(dǎo)肝臟炎癥應(yīng)激的過(guò)程。這些研究表明STC2 可能參與糖脂代謝，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，而DR 作為一種危害極大的糖尿病并發(fā)癥，STC2 在DR 中的表達(dá)及其調(diào)控功能尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。

Figure 5.STC2 induced VEGF expression and promoted its secretion in rat retinal ganglion cells.A：the mRNA level of VEGF was examined by RT-qPCR；B：the protein level of VEGF was tested by Western blot；C：the relative protein level of VEGF was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of VEGF was examined by ELISA.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs PBS group.圖5 STC2誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中VEGF的表達(dá)并促進(jìn)其分泌

Figure 6.The interaction between VEGF and STC2 in rat retinal ganglion cells.A：the total protein was pretreated with Protein A/G agarose beads for 1 h，divided into 2 tubes and incubated with IgG and anti-VEGF antibody，respectively；B：the semiquantitation for the band of STC2 was achieved by Quantity One software.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs IgG group.圖6 在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中VEGF與STC2存在相互作用

VEGF 信號(hào)通路在DR 過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［15-16］，越來(lái)越多的研究都發(fā)現(xiàn)VEGF 在糖尿病視網(wǎng)膜異常增生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，因此我們檢測(cè)了DR 大鼠中VEGF 的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，DR 大鼠玻璃體中VEGF 的表達(dá)水平也顯著升高。這一結(jié)果與以往的研究是一致的。我們進(jìn)一步分析了玻璃體中VEGF 的分泌情況，發(fā)現(xiàn)DR 大鼠玻璃體潤(rùn)洗液中VEGF 的水平也顯著增加?？紤]到STC2 在DR 大鼠玻璃體的異常表達(dá)，本研究分析了STC2 與VEGF 在DR 大鼠玻璃體中的關(guān)系。Pearson 積矩相關(guān)分析顯示，STC2 的 mRNA 水平與 VEGF 的 mRNA 水平呈非常明顯的正相關(guān)關(guān)系，STC2 和VEGF 分泌蛋白的表達(dá)亦呈顯著正相關(guān)相關(guān)，提示STC2 和VEGF 可能在DR過(guò)程中存在相互作用關(guān)系。

為了進(jìn)一步探究在DR 過(guò)程中STC2 與VEGF 的相互作用關(guān)系，本研究利用大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分析 STC2 對(duì) VEGF 以及 VEGF 對(duì) STC2 的調(diào)節(jié)作用。首先，本研究發(fā)現(xiàn)VEGFA 能夠在mRNA 和蛋白水平誘導(dǎo)STC2的表達(dá)，并且ELISA 的結(jié)果也說(shuō)明VEGFA能夠促進(jìn)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分泌STC2。而VEGF 在DR 過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，介導(dǎo)視網(wǎng)膜異常增生的過(guò)程，VEGF 可以促進(jìn)STC2 的表達(dá)以及分泌水平，提示STC2極有可能是VEGF 信號(hào)通路的重要靶基因。分子間相互作用是體內(nèi)分子功能調(diào)節(jié)的重要方面，因此本研究進(jìn)一步分析STC2 對(duì)于VEGF 是否存在正反饋的調(diào)節(jié)。用STC2蛋白處理大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)STC2 能夠誘導(dǎo)VEGF 的表達(dá)，說(shuō)明在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中STC2 和VEGF 存在正反饋的調(diào)節(jié)。免疫共沉淀結(jié)果則顯示VEGF與STC2存在蛋白相互作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了STC2 在DR 大鼠玻璃體中的異常表達(dá)，并且STC2 的表達(dá)與視網(wǎng)膜病變相關(guān)分子VEGF 存在正相關(guān)的作用關(guān)系，并且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了STC2 與VEGF 存在正反饋調(diào)節(jié)。這表明STC2 可能在DR 過(guò)程中發(fā)揮重要的功能，可能成為DR 重要的分子靶點(diǎn)，這也為開(kāi)發(fā)干預(yù)DR藥物提供了理論支持。