肖 雪，侯翠柳，王筱筱，陳立瑞，楊 慧，田 翠，王紅霞△

（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1生理與病理生理學(xué)系，2病理學(xué)系，北京100069）

高血壓是心血管疾病重要的危險(xiǎn)因素之一，其患病率逐年升高［1］。高血壓病的顯著病理特征之一為血管重塑，其中血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的表型轉(zhuǎn)換在血管重塑中起著重要的作用［2］。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VSMCs 在血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）等因素的作用下可發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)為收縮型VSMCs 標(biāo)志蛋白［如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）］表達(dá)減少，而分泌型VSMCs 標(biāo)志蛋白［如骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥因子］表達(dá)增加，進(jìn)而引起血管重塑［3-4］，但引起表型轉(zhuǎn)換的機(jī)制尚不完全清楚。有研究顯示，血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）可抑制VSMCs收縮型標(biāo)志物的表達(dá)，使其由收縮型轉(zhuǎn)換為分泌型［5］，在血管重塑的發(fā)生中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

CD1d 依賴的自然殺傷T 細(xì)胞（natural killer T cells，NKT 細(xì)胞）是一種新型的T 細(xì)胞亞群。不同于傳統(tǒng)的T 細(xì)胞，NKT 細(xì)胞只識(shí)別由細(xì)胞膜蛋白CD1d提呈的糖脂類抗原，CD1d基因的敲除則導(dǎo)致NKT 細(xì)胞無法激活［6］。α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-galactosylce?ramide，α-GC）為NKT 細(xì)胞最經(jīng)典及活性最強(qiáng)的外源性配基，它可與CD1d 結(jié)合而形成穩(wěn)定的CD1d-糖脂共價(jià)結(jié)合物，從而激活 NKT 細(xì)胞［7］。NKT 細(xì)胞被激活后可分泌大量促炎細(xì)胞因子［如干擾素γ（inter?feron-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等］及抗炎細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-10 等）來調(diào)節(jié)其它免疫細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、T 細(xì)胞及B 細(xì)胞）的激活，因此NKT 細(xì)胞被認(rèn)為是聯(lián)系先天和獲得性免疫的“橋梁”［6］。有研究證實(shí)，NKT 細(xì)胞參與多種心血管疾病的發(fā)生，如其激活可減輕心肌缺血/再灌注損傷［8］、梗死后心肌重塑及心衰等［9］。我們前期研究的結(jié)果顯示，NKT 細(xì)胞失活可加重高血壓引起的心臟損傷及心肌重塑［10］，還可加重Ang II 灌注引起的血壓升高及血管損傷，但其是否影響VSMCs表型轉(zhuǎn)換，目前尚不清楚。

本研究在CD1d基因敲除（CD1dgene knockout，CD1d-KO）小鼠及給予 α-GC 的野生型（wild-type，WT）小鼠上，給予Ang II 灌注，觀察NKT 細(xì)胞失活及激活對(duì)血壓、血管重塑及主動(dòng)脈組織平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響，并檢測(cè)PDGFβ 表達(dá)的變化，探討其在血管重塑中的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取 6～8 周 SPF 級(jí) C57BL/6J 雄性 WT 小鼠，體重20～25 g，購(gòu)買于北京維通利華公司。CD1d-KO 小鼠購(gòu)自Jackson Laboratory。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于首都醫(yī)科大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)和繁殖。所有研究工作均遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及使用指南》，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要試劑

Ang II（A9525）和三溴乙醇（T48402）均購(gòu)于Sig?ma；RIPA 裂解液（R0010）購(gòu)于索萊寶公司；α-GC（KRN7000）購(gòu)于Funakoshi；PVDF 膜（ISEQ00010）購(gòu)自 Immobilon；抗 α-SMA 抗體（sc-53142）購(gòu)于 Santa Cruz 生物公司；抗 OPN 抗體（22952-1-IP）購(gòu)于 Pro?teintech；抗PDGFRβ 抗體（ET1605-20）購(gòu)于杭州華安生物技術(shù)有限公司；鼠源（7076P2）及兔源（7074P2）II抗購(gòu)于Cell Signaling Technology。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組 （1）NKT 細(xì)胞失活實(shí)驗(yàn)：將WT 小鼠及CD1d-KO小鼠隨機(jī)分為4組（每組5～8只），分別為對(duì)照組（WT+saline 組和CD1d-KO+saline 組）及實(shí)驗(yàn)組（WT+Ang II 組和CD1d-KO+Ang II 組）。對(duì)照組小鼠給予生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組給予490 ng·kg-1·min-1劑量的Ang II，緩釋泵持續(xù)灌注 14 d。（2）NKT 細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)：將WT小鼠隨機(jī)分為4組（每組5～8只），分別為對(duì)照組（WT+saline 組和WT+α-GC 組）及實(shí)驗(yàn)組（WT+Ang II組和WT+Ang II+α-GC組）。

3.2 模型制備 本實(shí)驗(yàn)對(duì)C57BL/6J 小鼠灌注Ang II（490 ng·kg-1·min-1）引發(fā)高血壓反應(yīng)，從而制備小鼠高血壓模型［11］，使用Alzet緩釋泵灌注14 d，間斷監(jiān)測(cè)血壓，血壓≥140 mmHg 即為模型制備成功。小鼠稱重，計(jì)算所需Ang II 劑量，泵速0.25 μg/h，每只泵體積100 μL，于超凈臺(tái)下灌泵，37℃孵育4～6 h 或過夜。小鼠用3%的三溴乙醇溶液腹腔麻醉，常規(guī)消毒實(shí)驗(yàn)組小鼠耳后皮膚，剪開約1 cm長(zhǎng)的切口，將泵埋入淺筋膜下層，泵開口朝向小鼠尾部?？p合皮膚，待小鼠生命體征平穩(wěn)后送回鼠房飼養(yǎng)14 d，間斷尾套法監(jiān)測(cè)小鼠血壓。從埋泵前一天開始，以100μg/kg的劑量隔天腹腔注射α-GC。

3.3 血管取材 將小鼠麻醉并固定于操作板上，打開胸腔后用肝素生理鹽水灌注心血管循環(huán)系統(tǒng)，剪取分離小鼠主動(dòng)脈。用于提取總蛋白的組織用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱；用于病理檢查的組織固定于4%甲醛中，之后用石蠟包埋切片，脫蠟后進(jìn)行HE和Masson染色。

3.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 將小鼠主動(dòng)脈組織在RIPA裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）中剪碎，勻漿，用超聲波細(xì)胞破碎儀低溫裂解細(xì)胞，4℃、16 000×g離心15 min，取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。每組動(dòng)物組織取50μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，I抗4℃孵育過夜，次日洗滌 I 抗 3 次，孵育 II 抗 1 h，洗滌 II 抗 4 次，化學(xué)發(fā)光法顯影。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CD1d敲除加重Ang II灌注引起的血壓升高

與對(duì)照組（WT+saline 組）相比，灌注Ang II 后小鼠血壓顯著升高（P＜0.05），而CD1d敲除（NKT 細(xì)胞失活）則加重Ang II 灌注引起的血壓升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Effect of Ang II infusion for 14 d on blood pressure of WT and CD1d-KO mice.Mean±SEM. n=8.*P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖1 無創(chuàng)尾套法檢測(cè)Ang II 灌注14 d 后WT 及CD1d-KO小鼠的血壓變化

2 CD1d 敲除加重Ang II 灌注引起的血管重塑，而NKT細(xì)胞激活則減輕上述改變

與WT+saline 組相比，Ang II 灌注引起小鼠血管壁增厚，膠原沉積增多，纖維化明顯，CD1d敲除加重了Ang II灌注引起的上述變化（P＜0.05），見圖2A；而給予NKT 細(xì)胞特異性激活劑α-GC 則減輕了上述改變（P＜0.05），見圖2B。

3 CD1d 敲除加重Ang II 灌注引起的VSMCs 表型轉(zhuǎn)換

與WT+saline 組相比，Western blot 結(jié)果顯示Ang II灌注顯著減少小鼠VSMCs 收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)（P＜0.05），增加小鼠VSMCs 分泌型蛋白OPN的表達(dá)（P＜0.05）；CD1d敲除后上述改變進(jìn)一步加重（P＜0.05），見圖3。

4 NKT 細(xì)胞激活減輕Ang II 灌注引起的VSMCs表型轉(zhuǎn)換

與 Ang II 組相比，灌注 Ang II 同時(shí)給予 α-GC 可顯著增加α-SMA 的表達(dá)（P＜0.05），減少OPN 的表達(dá)（P＜0.05），見圖4。

5 NKT 細(xì)胞通過影響PDGFRβ 的表達(dá)而參與Ang II灌注引起的VSMCs表型轉(zhuǎn)換

與WT+saline 組相比，灌注Ang II 后小鼠主動(dòng)脈組織中PDGFRβ表達(dá)顯著增加，CD1d敲除進(jìn)一步增加 PDGFRβ 的表達(dá)水平（P＜0.05），而 α-GC 則降低PDGFRβ的表達(dá)（P＜0.05），見圖5。

討 論

在本研究中，我們證實(shí)了NKT 細(xì)胞失活可進(jìn)一步加重Ang II 灌注引起的小鼠VSMCs 表型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而加重血管重塑，且進(jìn)一步上調(diào)小鼠動(dòng)脈組織中PDGFRβ 的表達(dá)水平，而NKT 細(xì)胞特異性激動(dòng)劑α-GC 可以顯著減輕以上改變，從而提示NKT 細(xì)胞可能通過影響PDGFRβ表達(dá)參與VSCMs的表型轉(zhuǎn)換。

既往研究證實(shí)，VSMCs表型轉(zhuǎn)換是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管重塑性疾病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)［12］。當(dāng)血管受到刺激之后，收縮型VSMCs去分化轉(zhuǎn)換為具有較強(qiáng)分泌能力及增殖能力的分泌型VSMCs 來適應(yīng)環(huán)境變化，可分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白引起血管壁增厚，進(jìn)而引起血管重塑［3］。Guzik 等［13］的研究顯示，缺乏T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的RAG-1-/-小鼠具有遲鈍的高血壓反應(yīng)，過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞而不是B細(xì)胞恢復(fù)了小鼠對(duì)高血壓刺激因素的正常反應(yīng)，并且在給予小鼠Ang II 后檢測(cè)到血管中的T 細(xì)胞表面標(biāo)志物CD3及T細(xì)胞受體顯著增加，證明T細(xì)胞在高血壓的病理生理進(jìn)程中具有重要作用。有研究顯示，自發(fā)性高血壓大鼠血管組織中收縮蛋白α-SMA 下調(diào)，而合成蛋白OPN 上調(diào)，表明在高血壓發(fā)生與發(fā)展的過程中發(fā)生了VSMCs的表型轉(zhuǎn)換［14］。我們之前的結(jié)果也顯示，Ang II顯著增加小鼠動(dòng)脈組織炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，而作為先天與獲得性免疫的“橋梁”的NKT 細(xì)胞失活后進(jìn)一步增加炎癥細(xì)胞在小鼠動(dòng)脈組織的聚集，這些結(jié)果提示NKT細(xì)胞參與了高血壓的發(fā)生，其激活后可拮抗高血壓的發(fā)展［15］，但NKT 細(xì)胞是否參與高血壓引起的VSMCs表型轉(zhuǎn)換尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，NKT 細(xì)胞失活可進(jìn)一步下調(diào)Ang II 灌注引起的收縮型蛋白α-SMA 的表達(dá)，上調(diào)分泌型蛋白OPN的表達(dá)，而NKT細(xì)胞激活則減輕上述變化，提示NKT 細(xì)胞作為一種新型的T 細(xì)胞亞群，也參與了高血壓小鼠的VSMCs表型轉(zhuǎn)換及血管重塑。

Figure 2.Effects of NKT cell inactivation（CD1d-KO；A）and activation（α-GC treatment；B）on Ang II-induced remodeling of aor?tic tissues.The vascular wall thickness was measured by HE staining，while collagen deposition was observed by Masson staining.Scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=5. *P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖2 HE和Masson染色檢測(cè)CD1d敲除及NKT細(xì)胞激活對(duì)Ang II灌注引起的血管重塑的影響

Figure 3.Effects of CD1d-KO（NKT cell inactivation）on OPN and α-SMA protein expression in aortic tissues after Ang II infusion.Mean±SEM. n=5. *P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖3 CD1d敲除對(duì)灌注Ang II后主動(dòng)脈組織中OPN和α-SMA表達(dá)的影響

Figure 4.Effects of α-GC（NKT cell activation）on OPN and α-SMA protein expression in aortic tissues after Ang II infusion.Mean±SEM. n=5.*P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖4 NKT細(xì)胞激活對(duì)灌注Ang II后主動(dòng)脈組織中OPN和α-SMA表達(dá)的影響

Figure 5.Effects of CD1d-KO（NKT cell inactivation）and α-GC（NKT cell activation）on PDGFRβ protein expression in aortic tissues after Ang II infusion.Mean±SEM. n=5. *P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖5 CD1d敲除及NKT細(xì)胞激活對(duì)灌注Ang II后主動(dòng)脈組織中PDGFRβ表達(dá)的影響

有研究顯示，PDGF 可抑制VSMCs 收縮型標(biāo)志物的表達(dá)，表明PDGF 調(diào)節(jié)VSMCs 去分化且促進(jìn)了其由收縮型向分泌型轉(zhuǎn)換［5，12］。PDGF 是脈管系統(tǒng)遷移和增殖的發(fā)育過程中所必需的一種重要的促有絲分裂因子，可形成二聚體結(jié)構(gòu)如PDGF-AA 和PDGFBB，與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體PDGFRα 和PDGFRβ 結(jié)合后具有刺激特定細(xì)胞群分裂、增殖的能力［16］。蔣健等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑通過下調(diào)PDGF 的表達(dá)抑制VSMCs 表型轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步驗(yàn)證了PDGF 在VSMCs 表型轉(zhuǎn)換中的重要作用。本研究顯示，CD1d敲除進(jìn)一步促進(jìn)Ang II 灌注引起的PDGFRβ 表達(dá)上調(diào)，而給予 α-GC 減輕 Ang II 灌注引起的上述變化，提示NKT 細(xì)胞可能是通過調(diào)節(jié)小鼠主動(dòng)脈組織中PDGFRβ的表達(dá)來調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)換，從而參與血管重塑的發(fā)生。

綜上所述，NKT 細(xì)胞失活可加重Ang II 灌注引起的血壓升高、血管重塑及VSMCs表型轉(zhuǎn)換，上調(diào)血管組織中PDGFRβ 的表達(dá)，而NKT 細(xì)胞激活則減輕上述變化。以上結(jié)果提示NKT 細(xì)胞可能通過影響PDGFRβ 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)VSMCs 表型轉(zhuǎn)換，參與血管重塑。