劉常明，朱偉林，王巍

浦東新區(qū)人民醫(yī)院眼科，上海 201299

過(guò)敏性結(jié)膜炎不僅僅表現(xiàn)為眼部瘙癢不適，還可能損害眼表功能和結(jié)構(gòu)，給患者造成致盲的風(fēng)險(xiǎn)。印跡細(xì)胞學(xué)應(yīng)用于眼表疾病的取材及診斷已有多年，近年來(lái)與多種技術(shù)相結(jié)合，印跡細(xì)胞學(xué)有了更廣闊的應(yīng)用前景，也為過(guò)敏性結(jié)膜炎的檢查和診斷提供了新的方法。本研究將過(guò)氧化物酶免疫組化染色技術(shù)應(yīng)用于印跡細(xì)胞標(biāo)本，旨在探討氧化損傷對(duì)過(guò)敏性結(jié)膜炎發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 選取2017年3月至2018年10月期間在浦東新區(qū)人民醫(yī)院眼科就診的過(guò)敏性結(jié)膜炎患者50例納入觀(guān)察組，正常對(duì)照志愿者50例納入對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入組者均自愿作為受試對(duì)象，配合相關(guān)檢查；過(guò)敏性結(jié)膜炎患者均有眼刺癢，流淚，畏光，黏液性分泌物等癥狀，伴有結(jié)膜充血，水腫、大量乳頭、濾泡等體征[1]。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性感染性角膜炎、結(jié)膜炎；長(zhǎng)期配戴角膜接觸鏡者；已行角膜屈光矯正手術(shù)者。

1.2 方法

1.2.1 試劑 鼠抗人過(guò)氧化物酶單克隆抗體，羊抗鼠二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑等主要試劑均購(gòu)自上海復(fù)能生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 標(biāo)本采集 0.4%的奧布卡因滴右眼，表面麻醉1～2 min后，用鑷子將醋酸纖維薄膜貼于距角膜緣2 mm處上方球結(jié)膜表面，5～10 s后撕下，標(biāo)本標(biāo)注編號(hào)，先置于液氮罐中，后放置于-80°C冰箱保存。

1.2.3 HE染色 觀(guān)察組和對(duì)照組各隨機(jī)選擇10例標(biāo)本做HE染色，觀(guān)察醋酸纖維膜印取結(jié)膜上皮細(xì)胞數(shù)量，以確定能否滿(mǎn)足過(guò)氧化物酶免疫染色需要。

1.2.4 過(guò)氧化物酶免疫染色及陽(yáng)性細(xì)胞判定確定醋酸纖維膜印取結(jié)膜上皮細(xì)胞數(shù)量能夠滿(mǎn)足過(guò)氧化物酶免疫染色需要后，余下標(biāo)本使用Leica BoND-MAX全自動(dòng)免疫組化染色儀做過(guò)氧化物酶免疫染色檢測(cè)。細(xì)胞胞漿呈棕黃色且染色強(qiáng)度高于背景非特異性染色判定為染色陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.5 鏡檢 光鏡下統(tǒng)計(jì)過(guò)氧化物酶細(xì)胞染色陽(yáng)性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的HE染色情況 觀(guān)察組和對(duì)照組標(biāo)本HE染色提示醋酸纖維膜印取結(jié)膜上皮細(xì)胞數(shù)量豐富，均能夠滿(mǎn)足后續(xù)過(guò)氧化物酶免疫染色操作需要，見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 觀(guān)察組標(biāo)本HE染色(HE×400)

圖2 對(duì)照組標(biāo)本HE染色(HE×400)

2.2 兩組行過(guò)氧化物酶免疫染色檢測(cè)的受檢者性別和年齡比較 兩組行過(guò)氧化物酶免疫染色檢測(cè)的受檢者各40例，其中觀(guān)察組男性19例，女性21例；對(duì)照組男性19例，女性21例，兩組受檢者的性別構(gòu)成比比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0，P＞0.05)；觀(guān)察組患者的平均年齡為(41.60±17.47)歲，與對(duì)照組的(41.68±18.01)歲比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.02，P＞0.05)。

2.3 兩組受檢者的過(guò)氧化物酶染色結(jié)果比較 觀(guān)察組患者的過(guò)氧化物酶細(xì)胞染色陽(yáng)性率為(27.75±9.54)%，明顯高于對(duì)照組的(5.00±3.92)%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.95，P＜0.01)，見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 對(duì)照組結(jié)膜細(xì)胞過(guò)氧化物酶染色(免疫組織化學(xué)染色×400)

圖4 觀(guān)察組患者過(guò)氧化物酶染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多(免疫組織化學(xué)染色×400)

2.4 觀(guān)察組患者不同性別和年齡的過(guò)氧化物酶細(xì)胞染色陽(yáng)性率比較 觀(guān)察組患者中男性過(guò)氧化物酶細(xì)胞染色陽(yáng)性率為(25.52±10.26)%，與女性的(29.76±8.58)%比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.01，P＞0.05)；觀(guān)察組患者中40歲以上過(guò)氧化物酶細(xì)胞染色陽(yáng)性率為(25.29±9.43)%，與40歲及以下的(29.57±9.40)%比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.03，P＞0.05)。

3 討論

過(guò)敏性結(jié)膜炎是臨床常見(jiàn)的一種眼表疾病，發(fā)病率高，全球約20%的人有過(guò)敏性結(jié)膜炎病史[2]。過(guò)敏性結(jié)膜炎分為：季節(jié)性過(guò)敏性結(jié)膜炎、常年性過(guò)敏性結(jié)膜炎、春季角結(jié)膜炎、特應(yīng)性角結(jié)膜炎、巨乳頭性結(jié)膜炎。過(guò)敏性結(jié)膜炎的常見(jiàn)癥狀包括眼癢、眼干、異物感、燒灼感等，患者眼部奇癢難耐，癥狀反復(fù)發(fā)作，遷延不愈；過(guò)敏性結(jié)膜炎可以導(dǎo)致干眼的發(fā)生[3]，給患者造成明顯不適；過(guò)敏性結(jié)膜炎損害眼表功能和結(jié)構(gòu)[4]，部分類(lèi)型可累及角膜，危害視力，激素的使用還可能升高眼內(nèi)壓，誘發(fā)青光眼，給患者造成致盲風(fēng)險(xiǎn)[5]；過(guò)敏性結(jié)膜炎患者常合并有過(guò)敏性鼻炎、支氣管哮喘等全身疾病，嚴(yán)重影響患者的工作和生活。為了更有效的治療這種常見(jiàn)的眼表疾病，研究其發(fā)生機(jī)制就尤為重要。

有研究表明，眼表在接觸變應(yīng)原后，與已致敏的結(jié)膜肥大細(xì)胞結(jié)合，肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、類(lèi)胰蛋白酶、前列腺素、白三烯等遞質(zhì)，引起過(guò)敏性結(jié)膜炎的早期急性反應(yīng)，主要特征是血管擴(kuò)張，血管壁通透性增高，結(jié)膜充血水腫[6]。近年的研究提示，在早期急性反應(yīng)6～8 h后進(jìn)入變應(yīng)性疾病的慢性階段，氧化損傷和炎癥反應(yīng)很可能參與其中，主要特征是組織細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧產(chǎn)物，過(guò)氧化物酶表達(dá)增強(qiáng)，活性升高。過(guò)量的活性氧產(chǎn)物和氧自由基是引起氧化損傷的重要因素，氧化損傷能導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)釋放和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[7-9]，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起慢性無(wú)菌性炎癥[10-12]。

有研究顯示，在眼表變應(yīng)性疾病的慢性階段，結(jié)膜嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，過(guò)氧化物酶水平明顯升高[13]。過(guò)氧化物酶增高被認(rèn)為是活性氧產(chǎn)物和氧自由基對(duì)機(jī)體組織產(chǎn)生氧化損傷的重要標(biāo)志[14]。過(guò)氧化物酶免疫染色已廣泛用于全身多系統(tǒng)疾病如甲狀腺疾病[15]、腎病[16]、心血管病[17]、血液病[18]等疾病的診斷。染色原理是利用過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合，使酶催化底物，將過(guò)氧化氫中的氧釋放出來(lái)而產(chǎn)生新生態(tài)的氧，此新生態(tài)氧使無(wú)色的二氨基聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺，聯(lián)苯胺是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，它可以進(jìn)一步氧化變成棕色的化合物。過(guò)氧化物酶免疫染色產(chǎn)生有色產(chǎn)物，顯示抗原所在的部位。胞漿內(nèi)過(guò)氧化物酶含量不同，染色顯示的棕色也出現(xiàn)深淺的不同。

植物花粉和污染的空氣是常見(jiàn)的變應(yīng)原[19]。植物花粉管在高活性過(guò)氧化物酶的促進(jìn)作用下，得以生長(zhǎng)發(fā)育[20]，當(dāng)花粉與人體接觸后，過(guò)氧化物酶會(huì)誘導(dǎo)黏膜細(xì)胞產(chǎn)生活性氧產(chǎn)物和氧自由基，氧化損傷導(dǎo)致白細(xì)胞介素等炎癥介質(zhì)的釋放[21]，并且導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[22]；污染的空氣中也含有大量活性氧產(chǎn)物和氧自由基，容易對(duì)眼表細(xì)胞造成氧化損傷[23]。

盡管LEONARDI等[24]的研究顯示過(guò)敏性結(jié)膜炎患者淚液中過(guò)氧化物酶活性顯著增高，但是直接檢測(cè)結(jié)膜上皮細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶卻鮮有報(bào)道。本研究是將過(guò)氧化物酶免疫染色技術(shù)應(yīng)用于結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，觀(guān)察過(guò)敏性結(jié)膜炎患者結(jié)膜上皮細(xì)胞過(guò)氧化物酶的表達(dá)及氧化損傷對(duì)過(guò)敏性結(jié)膜炎發(fā)病的影響。印跡細(xì)胞學(xué)作為一種快速方便易行、無(wú)創(chuàng)傷并可提供大量信息的眼表細(xì)胞學(xué)檢查方法，多年來(lái)廣泛用于眼表疾病的研究。近年來(lái)隨著大量新技術(shù)如過(guò)氧化物酶免疫染色、電鏡及流式細(xì)胞學(xué)等應(yīng)用于印跡細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，印跡細(xì)胞學(xué)有了更廣闊的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果顯示過(guò)敏性結(jié)膜炎患者結(jié)膜上皮細(xì)胞過(guò)氧化物酶活性升高，表達(dá)增強(qiáng)，過(guò)敏性結(jié)膜炎組患者的過(guò)氧化物酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯高于對(duì)照組，兩組過(guò)氧化物酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。本研究結(jié)論說(shuō)明氧化損傷對(duì)過(guò)敏性結(jié)膜炎的發(fā)生有顯著影響，提示除了抗過(guò)敏、抗炎治療外，抗氧化治療可能是治療過(guò)敏性結(jié)膜炎的一個(gè)新思路。SEO等[25]通過(guò)一項(xiàng)針對(duì)6～12歲少年兒童的研究顯示，口服抗氧化劑如維生素C等可以減少變應(yīng)性疾病的發(fā)生，這與本文的結(jié)論一致。過(guò)敏性結(jié)膜炎組不同性別、不同年齡組間過(guò)氧化物酶表達(dá)無(wú)顯著差異，提示過(guò)敏性結(jié)膜炎是男女都可發(fā)病、并且終身都可能發(fā)生的一種疾病。本結(jié)論對(duì)研究過(guò)敏性結(jié)膜炎的發(fā)病機(jī)制，推進(jìn)新技術(shù)在過(guò)敏性結(jié)膜炎診斷中的應(yīng)用，探討過(guò)敏性結(jié)膜炎的綜合治療等，均具有一定的臨床意義。

志謝：本科研項(xiàng)目得到上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院病理科王登山主任和醫(yī)務(wù)部顧曉鳴主任的大力幫助。