楊洋，王春暉，王寶西，王琳

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710038；2.長安醫(yī)院兒科，陜西 西安 710016

先天性巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染是新生兒出生2周內(nèi)被CMV感染母親傳染引起，全球活產(chǎn)新生兒CMV感染率約0.7%，CMV感染可導(dǎo)致新生兒感音神經(jīng)性耳聾、視力障礙、智力發(fā)育遲緩等疾病[1]，嚴(yán)重影響其生長發(fā)育，降低其生活質(zhì)量，給患兒、家庭及社會(huì)帶來嚴(yán)重的不良影響。早期發(fā)現(xiàn)CMV感染是預(yù)防胎兒宮內(nèi)感染和新生兒感染的主要途徑，但對(duì)于已感染患兒，如何進(jìn)行良好的干預(yù)十分重要。其中，對(duì)于CMV感染新生兒其喂養(yǎng)方式尚存較大爭議，母乳喂養(yǎng)是否增加CMV感染新生兒CMV病毒載量尚無一致性結(jié)論。本研究探討母乳喂養(yǎng)與人工喂養(yǎng)對(duì)CMV病毒載量的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年7月至2019年6月空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科診治的82例CMV感染無癥狀新生兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①CMV病毒血清學(xué)證實(shí)母親為原發(fā)性CMV感染；②新生兒出生2周內(nèi)經(jīng)實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測到CMV[2]；③足月產(chǎn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性心臟病、畸形、早產(chǎn)兒；②先天性免疫缺陷性疾?。虎勰赣H妊娠期間合并糖尿病、高血壓等其他合并癥或并發(fā)癥。根據(jù)喂養(yǎng)方式不同將其分為兩組，觀察組31例，采用母乳喂養(yǎng)，其中男性19例，女性12例；日齡2～11 d，平均(5.32±2.16)d；出生方式：剖宮產(chǎn)20例，陰道分娩11例；出生孕周36～41周，平均(38.25±2.61)周。對(duì)照組51例，采用人工喂養(yǎng)，其中男性 29例，女性 22例；日齡 3～12 d，平均(5.39±2.05)d；出生方式：剖宮產(chǎn)33例，陰道分娩18例；出生孕周37～42周，平均(38.61±2.15)周。兩組新生兒性別、日齡、出生方式、出生孕周比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬均知情并簽署同意書。

1.2 方法 對(duì)照組新生兒采用配方牛乳制品喂養(yǎng)，喂養(yǎng)量根據(jù)每日嬰兒日需能量(100～120 kcal/kg)計(jì)算[3]。觀察組新生兒采用純母乳喂養(yǎng)，根據(jù)新生兒需求隨時(shí)進(jìn)行母乳喂養(yǎng)。

1.3 CMV病毒載量檢測 所有新生兒均于出生后3 d內(nèi)、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月(觀察組于新生兒出生1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月)采集母乳、采集唾液或尿液標(biāo)本檢測CMV DNA，72 h內(nèi)完成檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法：具體步驟：①DNA模板提?。悍謩e吸取50μL的陰性、弱陽性與強(qiáng)陽性質(zhì)控品于離心管，加入TRIzol(美國Invitrogen公司)提取總RNA，ND-1000紫外分光光度計(jì)(NanoDrop公司)檢測RNA純度和完整性。取20μg總RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：15℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min 滅活。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測：CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國Bio-Rad)檢測CMV DNA水平，qRT-PCR流程：將吸104、105、106、107copies/mL陽性參考品2μL置于PCR管，加入qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)液配制如下：0.4μL PCR引物F(10μmol/L)，0.4μL PCR 引物R(10 μmol/L)，1 μL PCR緩沖液(10×)，1μL dNTP(2.5 mmol/L)，0.6 μL氯化鎂溶液，0.5 U Taq聚合酶，0.2μL ROX Reference Dye，2.5μmol/L熒光染料SybergreenI，加水至8μL。反應(yīng)條件：95℃變性15 s 65℃退火20 s；75℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)感染消化學(xué)組制定CMV感染診斷方案對(duì)新生兒CMV載量進(jìn)行判定[4]，試劑盒均購自北京貝爾生物工程有限公司，檢測流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 隨訪 所有新生兒均定期采用門診定期復(fù)查或電話形式進(jìn)行隨訪，隨訪至出生后6個(gè)月，復(fù)查內(nèi)容包括外周血肝功能檢測、頭顱B超檢測腦發(fā)育情況、外周血常規(guī)分析，聽力篩查等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用重復(fù)測量方差分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組母乳CMV DNA載量比較 觀察組母親乳汁中CMV DNA載量在出生后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月分別為(3.12±0.62)×103、(2.69±0.35)×103、(2.64±0.37)×103，觀察組母親乳汁中不同時(shí)間段的CMV DNA載量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.032，P＞0.05)。

2.2 兩組新生兒的CMV DNA病毒載量比較 兩組新生兒出生3 d內(nèi)、出生1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月CMV DNA病毒載量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組新生兒不同時(shí)間的CMV DNA病毒載量比較(±s，×105)

表1 兩組新生兒不同時(shí)間的CMV DNA病毒載量比較(±s，×105)

組別觀察組對(duì)照組t值P值例數(shù)31 51出生后3 d 2.62±0.51 2.51±0.62 0.635 0.241出生1個(gè)月1.85±0.95 1.92±0.73 0.195 0.868出生3個(gè)月1.82±0.92 1.71±0.75 0.352 0.749出生6個(gè)月1.69±0.62 1.62±0.53 0.036 0.956 F值1.236 1.623 P值0.169 0.098

2.3 兩組新生兒的隨訪結(jié)果比較 所有患兒均獲得隨訪，出生后3 d、3個(gè)月、6個(gè)月聽力篩查觀察2例未通過，對(duì)照組1例未通過，肝功能檢查觀察組1例丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶偏高，對(duì)照組均正常，頭顱B超均未發(fā)現(xiàn)腦發(fā)育異常，血常規(guī)檢測觀察組1例中性粒細(xì)胞減少，1例貧血，對(duì)照組1例貧血，兩組肝功能異常、腦發(fā)育異常、中性細(xì)胞減少、貧血、聽力異常檢出率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 兩組新生兒隨訪結(jié)果比較[例(%)]

3 討論

CMV是人體感染細(xì)胞腫大形成的巨大核內(nèi)包涵體，胎兒宮內(nèi)CMV感染可導(dǎo)致出生缺陷或畸形，新生兒CMV感染可影響其生長發(fā)育。據(jù)報(bào)道10%～15%的CMV感染患兒在生長發(fā)育過程中可能產(chǎn)生感音性神經(jīng)性耳聾及認(rèn)知和神經(jīng)損害癥狀等后遺癥[5]。新生兒CMV感染通過產(chǎn)道、輸血、哺乳3種途徑獲得，其中母乳傳播是圍生期CMV感染的主要影響因素[6]。母乳CMV陽性嬰兒是否可以給予母乳喂養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)是否可增加新生兒CMV病毒載量或?qū)е吕^發(fā)CMV感染性尚存爭議。

本研究觀察乳汁CMV陽性產(chǎn)婦在新生兒出生后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月CMV DNA載量均≥1×103，均為陽性，但其載量并無顯著變化。CMV陽性乳汁喂養(yǎng)新生兒是否對(duì)新生兒CMV DNA載量產(chǎn)生影響？本研究進(jìn)一步觀察了新生兒尿液/唾液中CMV DNA載量變化，發(fā)現(xiàn)其尿液/唾液中CMV DNA載量在出生后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月均呈陽性，CMV DNA載量有下降趨勢，但是整體變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明母乳喂養(yǎng)不增加CMV陽性無癥狀新生兒CMV DNA載量，分析原因，主要為患兒出生時(shí)CMV病毒已經(jīng)在體內(nèi)存在和增殖，母乳喂養(yǎng)并不能引起感染加重和臨床癥狀嚴(yán)重。人工喂養(yǎng)患兒尿液/唾液中CMV DNA載量在出生后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月并無出現(xiàn)明顯下降，與人工喂養(yǎng)患兒比較，母乳喂養(yǎng)患兒CMV DNA載量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明喂養(yǎng)方式尚不對(duì)CMV DNA載量構(gòu)成影響。與張琳等[7]報(bào)道結(jié)果一致。

本研究通過隨訪觀察母乳喂養(yǎng)對(duì)CMV陽性無癥狀新生兒發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)觀察組患兒聽力異常2例，但與對(duì)照組比較無明顯差異，說明母乳喂養(yǎng)并不增加患兒聽力損害風(fēng)險(xiǎn)。觀察組出現(xiàn)1例丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，說明母乳喂養(yǎng)可能增加肝功能損害，具體原因不明，因此該結(jié)論尚待納入更多樣本加以證實(shí)。研究顯示CMV感染可引起腦室周圍鈣化、腦發(fā)育不全和實(shí)質(zhì)壞死[8]，木研究兩組頭顱B超均未發(fā)現(xiàn)腦室周圍鈣化和腦壞死，提示母乳喂養(yǎng)不引起CMV病毒載量增多，進(jìn)而不影響神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育。出現(xiàn)上述結(jié)果原因可能與本研究隨訪時(shí)間過短有關(guān)，也有可能頭顱B超對(duì)腦實(shí)質(zhì)病變敏感度低導(dǎo)致。本研究兩組貧血檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，觀察組1例中性粒細(xì)胞降低因呼吸道感染導(dǎo)致，因此尚不認(rèn)為母乳喂養(yǎng)可導(dǎo)致CMV的繼發(fā)感染。

CMV感染是導(dǎo)致感音性神經(jīng)性耳聾的危險(xiǎn)因素，CMV感染可通過損傷上皮細(xì)胞，引起內(nèi)耳炎癥反應(yīng)導(dǎo)致患兒遠(yuǎn)期發(fā)生感音性神經(jīng)性耳聾。隨著患兒生長發(fā)育感音性神經(jīng)性耳聾癥狀可能逐漸加重，因此對(duì)無癥狀CMV感染患兒應(yīng)密切隨訪，定期進(jìn)行聽力篩查[9-10]。本研究對(duì)兩組患兒出生3 d、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月分別進(jìn)行聽力篩查，結(jié)果兩組聽力異常率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與隨訪時(shí)間過短有關(guān)，也可能與目前聽力篩查技術(shù)受耳蝸毛細(xì)胞功能影響較大，導(dǎo)致假陰性率低有關(guān)。腦干聽力誘導(dǎo)電位檢查對(duì)感音性神經(jīng)性耳聾更具敏感性[11]，因此對(duì)CMV陽性患兒定期進(jìn)行腦干聽力誘導(dǎo)電位檢查至青春期很有必要。總之目前尚不確定母乳喂養(yǎng)對(duì)CMV感染無癥狀患兒聽力是否產(chǎn)生影響，需要長時(shí)間隨訪加以證實(shí)。

綜上所述，本研究通過觀察母乳喂養(yǎng)和人工喂養(yǎng)對(duì)CMV陽性患兒唾液/尿液CMV DNA載量的影響，發(fā)現(xiàn)乳汁CMV陽性母乳喂養(yǎng)并不增加無癥狀CMV感染新生兒CMV病毒載量，亦不增加新生兒CMV繼發(fā)感染風(fēng)險(xiǎn)，母乳喂養(yǎng)對(duì)CMV感染患兒大腦發(fā)育、感音性神經(jīng)性耳聾影響尚待延長隨訪、提高檢測手段敏感性加以證實(shí)。