閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚類遠(yuǎn)緣雜交（distant hybridization）是對(duì)舊物種的改良和新物種的創(chuàng)造等重要魚類育種途徑之一[1]，目前，已在魚類的雜種優(yōu)勢(shì)、抗寒育種、單性雜種、多倍體、提高起捕率、誘發(fā)雌核發(fā)育、抗病育種和誘發(fā)雄核發(fā)育等方面取得了進(jìn)展[2-9]。但其不足就是雜交不易成功，種間隔離造成雜種不育，嚴(yán)重限制了遠(yuǎn)緣雜交親本的選擇范圍。而顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)可以彌補(bǔ)遠(yuǎn)緣雜交的不足。利用顯微注射技術(shù)，將外源基因組DNA 轉(zhuǎn)化到受體，是將經(jīng)過改良的新的性狀或相關(guān)性狀直接轉(zhuǎn)化受體的方法，克服了基因差異和生理差異所造成的遠(yuǎn)緣雜交原代不親和和后代不育等障礙，最終實(shí)現(xiàn)直接進(jìn)行外源DNA 水平的片段雜交[10-13]。但其檢測(cè)方法不能用魚類轉(zhuǎn)單個(gè)基因中一些常用的外源基因整合鑒定和表達(dá)檢測(cè)等技術(shù)，因?yàn)閷?dǎo)入的外源總DNA 沒有明確的分子標(biāo)記和一致的序列結(jié)構(gòu)。而使用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)不需要預(yù)先知道被研究魚類的DNA 序列信息，在受體基因組中，通過檢查擴(kuò)增目的DNA 片段的有無，來找到外源總DNA 轉(zhuǎn)化的分子證據(jù)，因此，AFLP 技術(shù)是一個(gè)快速檢測(cè)總DNA 的好方法。有關(guān)AFLP 技術(shù)在魚類總DNA 檢測(cè)方面已有過報(bào)道[14-17]。

鱖Siniperca chuatsi 肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含人體必需的氨基酸和鈣、鉀、鎂、硒等營(yíng)養(yǎng)元素，是一種名貴的肉食性淡水養(yǎng)殖魚類。鏡鯉Cyprinus carpio 生長(zhǎng)快，是一個(gè)多棲息水域中下層的常規(guī)淡水雜食性魚類。目前，已選育出適合池塘養(yǎng)殖的德國(guó)鏡鯉選育系，也是主要的池塘鯉養(yǎng)殖品種之一[18-20]。本研究通過顯微介導(dǎo)的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將未經(jīng)遺傳修飾的親緣關(guān)系甚遠(yuǎn)的優(yōu)異鱖基因組DNA 導(dǎo)入受體鏡鯉中，通過這種基因組水平的超遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，改善鏡鯉的肌肉品質(zhì)；用AFLP 方法檢測(cè)顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉，驗(yàn)證了在受體親本的基因組中整合了供體基因片段，再將與鱖相同的AFLP 條帶進(jìn)行切下、回收、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，供體鱖片段序列與顯微介導(dǎo)的鱖鏡鯉片段序列完全一致，進(jìn)一步明確了外源基因組DNA 轉(zhuǎn)化的分子證據(jù)。而顯微介導(dǎo)外源總DNA 轉(zhuǎn)化，為鯉科魚類肌肉品質(zhì)的改良，為魚類遠(yuǎn)緣、超遠(yuǎn)緣物種間的基因交流提供了有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供體基因是鱖總DNA。實(shí)驗(yàn)魚取自本課題組生產(chǎn)的顯微介導(dǎo)的鱖基因鏡鯉，顯微注射用的鏡鯉受精卵取自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站。

1.2 方法

1.2.1 鱖基因組DNA 的提取

用2mL 無菌一次性注射器，在鱖的尾部采新鮮血液10～15μL，加入含有400μL 裂解液的1.5mL 離心管中，混勻，裂解液為100mM EDTA，pH=8.0。放入55℃水浴消化1h 左右，期間將離心管顛倒幾次混勻，待溶液清澈透明后，取出離心管，加入等體積的體積比為酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1 的混合液，緩慢來回顛倒離心管15min，10000r/min 離心6min。另取一個(gè)干凈離心管裝入上層液體，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇（沉淀DNA），混勻，-20℃處理2h，離心，沉淀加70%乙醇洗滌離心，加100μL TE（tris-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA）溶解。

1.2.2 外源基因的導(dǎo)入

在繁殖季節(jié)，采集高質(zhì)量的卵子和精子進(jìn)行人工受精，利用外源基因的導(dǎo)入技術(shù)，將未經(jīng)遺傳修飾的鱖基因組DNA 導(dǎo)入鏡鯉受精卵的核區(qū)附近，注射量為1nL 左右。共導(dǎo)入2500 余粒鏡鯉受精卵，孵出仔魚1500 余尾，放入池塘300 尾正常飼養(yǎng)。

1.2.3 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉DNA 提取

取新鮮的鰭條，盡量剪碎裝入1.5mL 離心管中，加入裂解液，消化，等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液抽提，預(yù)冷的無水乙醇沉淀，TE 溶解。具體實(shí)驗(yàn)魚DNA 提取參見閆學(xué)春[21]。

1.2.4 AFLP 反應(yīng)體系的建立

1.2.4.1 酶切連接

本實(shí)驗(yàn)選用了兩種酶Mse I 和EcoR I 的酶切組合研究酶切效果。酶切總體系20μL，其中10×Buffer 2μL，BSA 0.2μL，模板DNA 400ng，Mse I 0.5μL，EcoR I 0.5μL，補(bǔ)ddH2O 至終體積20μL，混勻，37℃水浴2h，65℃滅活20min，終止酶切反應(yīng)，冰浴。連接體系：在裝有酶切產(chǎn)物的離心管中，依次加入Mse I 接頭1μL、EcoR I 接頭1μL、T4-DNA 連接酶0.5μL、連接酶Buffer 1μL，補(bǔ)ddH2O 至終體積30μL。過夜連接。

1.2.4.2 預(yù)擴(kuò)增

在加有1μL 連接產(chǎn)物的試管中加入EcoRⅠ引物1μL、Mse I 引物1μL、Taq DNA 聚合酶0.1μL 和Buffer 14.4μL，加水至20μL。混勻后，按如下PCR 擴(kuò)增 條 件：94℃變 性30s，56℃退 火1min，72℃延 伸1min，20 個(gè)循環(huán)，完成循環(huán)后再延伸6min（72℃）。

1.2.4.3 選擇性擴(kuò)增

建立25μL 選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系：加入稀釋10 倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1μL、MseⅠ選擇擴(kuò)增引物1μL、EcoRⅠ選擇擴(kuò)增引物1μL、Taq DNA 聚合酶0.3μL 和Buffer 18μL，加水至25μL?；靹蚝?，按如下PCR 條件擴(kuò)增：94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，進(jìn)行36 個(gè)循環(huán)，其中13 個(gè)循環(huán)后，每個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度降低0.7℃。

表1 AFLP 接頭及引物序列Tab.1 Adapters and primers sequences of AFLP

1.2.4.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

選擇擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（去離子甲酰胺98%、10 mmol/L EDTA、0.25%溴酚藍(lán)和0.25%二甲苯青），混勻，94℃變性10min 后，立刻冰浴冷卻待用。取5μL 變性后的樣品，6%的變性聚丙烯酰胺凝電泳檢測(cè)，55W 恒定功率電泳，電泳約2.5h。取下膠板固定，銀染[22，23]，照相，分析。

1.2.4.5 目的條帶回收測(cè)序

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將差異性條帶回收，測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉基因組DNA 提取

采用酚/氯仿混合提取方法提取的顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉基因組DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，基因組DNA 條帶清晰無彌散。DNA 定量分析儀分析表明，提取的基因組DNA 的OD260/OD280均在1.8～2.0 之間，表明蛋白質(zhì)、RNA 等雜質(zhì)含量極少，提取的顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉基因組DNA 純度高，符合AFLP 的后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求[24]（圖1）。

2.2 AFLP 擴(kuò)增結(jié)果

利用引物E-AGG，M-CTA，對(duì)顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉基因組DNA 進(jìn)行AFLP 檢測(cè)，以鱖基因組DNA 為陽性對(duì)照，普通鏡鯉基因組DNA 為陰性對(duì)照。在AFLP 的15 對(duì)引物中，在顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉中有3 對(duì)引物均擴(kuò)增出了供體鱖基因片段，在基因水平上驗(yàn)證了在受體親本的基因組中已整合了供體鱖基因片段（表1、圖2）。

2.3 產(chǎn)物回收測(cè)序結(jié)果

為進(jìn)一步找到遺傳證據(jù)，將與鱖相同的AFLP條帶進(jìn)行切下、回收、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，供體鱖片段序列與顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉片段序列完全一致（圖3）。

3 討論

AFLP 是第三代分子標(biāo)記技術(shù)，綜合了限制性酶切片段多樣性（RFLP）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的優(yōu)點(diǎn)，分析結(jié)果靈活性高，穩(wěn)定可靠，多態(tài)性豐富，不需要預(yù)知基因組的序列特征，適用于任何來源和各種復(fù)雜度的DNA[25]。自AFLP 技術(shù)問世以來，已廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)分析、遺傳分析、指紋多態(tài)性和外源基因檢測(cè)等方面。王朝溪等[26]利用AFLP 技術(shù)分析了青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii 群體間的遺傳差異，構(gòu)建了其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性的指紋圖譜，研究結(jié)果為青海湖裸鯉的多樣性檢測(cè)和親本選育提供了可靠的技術(shù)參數(shù)，對(duì)青海湖裸鯉資源庫(kù)積累具有指導(dǎo)意義。嚴(yán)駿驄等[27]運(yùn)用AFLP 技術(shù)從3 個(gè)層面分析了鰱Hypophthalmichthys molitrix 的土著群體、中國(guó)土著群體內(nèi)和海外移居群體的遺傳格局，結(jié)果表明3 個(gè)群體間的分化表現(xiàn)顯著，為鰱的種質(zhì)資源利用、保護(hù)和管理積累了基礎(chǔ)資料。王志勇等[28]分析了官井洋大黃魚Larimichthys crocea 指紋多態(tài)性的AFLP，為大黃魚種質(zhì)優(yōu)化提供了依據(jù)。Young 等[29]構(gòu)建了虹鱒Oncorhynchus mykiss 遺傳連鎖圖譜，利用476 個(gè)AFLP 分子標(biāo)記進(jìn)行了遺傳連鎖分析，得到主連鎖群32 個(gè)，小連鎖群11 個(gè)。佟廣香等[30]報(bào)道了利用AFLP 技術(shù)檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因鯉Cyprinus carpio，證明了與生態(tài)安全直接相關(guān)的是轉(zhuǎn)基因鯉逃逸的數(shù)量。閆學(xué)春等[16]報(bào)道了通過AFLP 的檢測(cè)與分析，驗(yàn)證了河蟹Eriocheir sinensi 總DNA 可通過顯微介導(dǎo)方式整合到鏡鯉基因組中，這與本研究結(jié)果一致。本研究建立了顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的AFLP 反應(yīng)體系，適合本研究顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的鑒定，其原理是先通過限制性內(nèi)切酶將顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的基因組DNA 雙酶切后，再通過將特定的接頭鏈接在其分子量大小不等的限制性酶切片段的兩端，對(duì)鏈接有特定接頭的片段進(jìn)行擴(kuò)增，先進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，再進(jìn)行選擇擴(kuò)增，因變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率較高，所以對(duì)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，通過條帶的多少，而獲得DNA 的多態(tài)性，進(jìn)而尋找實(shí)驗(yàn)所需要的特異條帶，再通過電泳圖譜查找是否含有供體基因片段。如果有供體基因片段，就證明了受體基因組中已成功整合了供體基因片段，其結(jié)果證明了AFLP 方法是檢測(cè)顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的有效工具[31，32]。

利用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將異源DNA 直接導(dǎo)入魚類進(jìn)行分子育種，可以豐富魚類遺傳基礎(chǔ)，擴(kuò)大變異類型，將傳統(tǒng)育種中難以利用的遠(yuǎn)緣基因轉(zhuǎn)移，為傳統(tǒng)育種提供新的種質(zhì)，對(duì)魚類育種工作有實(shí)踐意義[33，34]。鏡鯉和鱖在分類學(xué)上屬于兩個(gè)不同目，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種，通過常規(guī)的育種方法很難進(jìn)行雜交，主要受生物種間隔離限制而顯示了其不可回避的局限性，但通過顯微介導(dǎo)的方式將鱖基因組DNA 導(dǎo)入受體鏡鯉基因組中，可以克服常規(guī)雜交選育方法中各種雜交不親和性障礙，因此，顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)在創(chuàng)造魚類新品種、新類型方面存在著巨大的應(yīng)用前景。而利用鱖良好的遺傳資源，再結(jié)合顯微介導(dǎo)的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將這些有益的基因?qū)胧荏w魚中，就有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)受體魚的改良。本研究通過AFLP 指紋圖譜分析，在顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉中檢測(cè)到了鱖的特異片段，這從DNA 水平上證實(shí)了鱖的部分基因片段已滲入到顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉親本基因組中，說明了鱖總DNA導(dǎo)入受體鏡鯉獲得成功。轉(zhuǎn)基因是隨機(jī)插入，至于是哪部分基因插入到受體基因組中，發(fā)揮著什么作用，還有待進(jìn)一步研究。本研究是兩個(gè)基因組之間的雜交，盡管所滲入的供體基因組基因沒有轉(zhuǎn)目標(biāo)基因那么明確，但只要能使受體親本的目標(biāo)性狀達(dá)到改良的目的，就對(duì)鯉科魚類的肌肉品質(zhì)改良具有重要有意義[13]。