閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚(yú)類(lèi)育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚(yú)類(lèi)遠(yuǎn)緣雜交（distant hybridization）是對(duì)舊物種的改良和新物種的創(chuàng)造等重要魚(yú)類(lèi)育種途徑之一[1]，目前，已在魚(yú)類(lèi)的雜種優(yōu)勢(shì)、抗寒育種、單性雜種、多倍體、提高起捕率、誘發(fā)雌核發(fā)育、抗病育種和誘發(fā)雄核發(fā)育等方面取得了進(jìn)展[2-9]。但其不足就是雜交不易成功，種間隔離造成雜種不育，嚴(yán)重限制了遠(yuǎn)緣雜交親本的選擇范圍。而顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)可以彌補(bǔ)遠(yuǎn)緣雜交的不足。利用顯微注射技術(shù)，將外源基因組DNA 轉(zhuǎn)化到受體，是將經(jīng)過(guò)改良的新的性狀或相關(guān)性狀直接轉(zhuǎn)化受體的方法，克服了基因差異和生理差異所造成的遠(yuǎn)緣雜交原代不親和和后代不育等障礙，最終實(shí)現(xiàn)直接進(jìn)行外源DNA 水平的片段雜交[10-13]。但其檢測(cè)方法不能用魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)單個(gè)基因中一些常用的外源基因整合鑒定和表達(dá)檢測(cè)等技術(shù)，因?yàn)閷?dǎo)入的外源總DNA 沒(méi)有明確的分子標(biāo)記和一致的序列結(jié)構(gòu)。而使用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)不需要預(yù)先知道被研究魚(yú)類(lèi)的DNA 序列信息，在受體基因組中，通過(guò)檢查擴(kuò)增目的DNA 片段的有無(wú)，來(lái)找到外源總DNA 轉(zhuǎn)化的分子證據(jù)，因此，AFLP 技術(shù)是一個(gè)快速檢測(cè)總DNA 的好方法。有關(guān)AFLP 技術(shù)在魚(yú)類(lèi)總DNA 檢測(cè)方面已有過(guò)報(bào)道[14-17]。

鱖Siniperca chuatsi 肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含人體必需的氨基酸和鈣、鉀、鎂、硒等營(yíng)養(yǎng)元素，是一種名貴的肉食性淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。鏡鯉Cyprinus carpio 生長(zhǎng)快，是一個(gè)多棲息水域中下層的常規(guī)淡水雜食性魚(yú)類(lèi)。目前，已選育出適合池塘養(yǎng)殖的德國(guó)鏡鯉選育系，也是主要的池塘鯉養(yǎng)殖品種之一[18-20]。本研究通過(guò)顯微介導(dǎo)的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將未經(jīng)遺傳修飾的親緣關(guān)系甚遠(yuǎn)的優(yōu)異鱖基因組DNA 導(dǎo)入受體鏡鯉中，通過(guò)這種基因組水平的超遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，改善鏡鯉的肌肉品質(zhì)；用AFLP 方法檢測(cè)顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉，驗(yàn)證了在受體親本的基因組中整合了供體基因片段，再將與鱖相同的AFLP 條帶進(jìn)行切下、回收、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，供體鱖片段序列與顯微介導(dǎo)的鱖鏡鯉片段序列完全一致，進(jìn)一步明確了外源基因組DNA 轉(zhuǎn)化的分子證據(jù)。而顯微介導(dǎo)外源總DNA 轉(zhuǎn)化，為鯉科魚(yú)類(lèi)肌肉品質(zhì)的改良，為魚(yú)類(lèi)遠(yuǎn)緣、超遠(yuǎn)緣物種間的基因交流提供了有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供體基因是鱖總DNA。實(shí)驗(yàn)魚(yú)取自本課題組生產(chǎn)的顯微介導(dǎo)的鱖基因鏡鯉，顯微注射用的鏡鯉受精卵取自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站。

1.2 方法

1.2.1 鱖基因組DNA 的提取

用2mL 無(wú)菌一次性注射器，在鱖的尾部采新鮮血液10～15μL，加入含有400μL 裂解液的1.5mL 離心管中，混勻，裂解液為100mM EDTA，pH=8.0。放入55℃水浴消化1h 左右，期間將離心管顛倒幾次混勻，待溶液清澈透明后，取出離心管，加入等體積的體積比為酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1 的混合液，緩慢來(lái)回顛倒離心管15min，10000r/min 離心6min。另取一個(gè)干凈離心管裝入上層液體，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇（沉淀DNA），混勻，-20℃處理2h，離心，沉淀加70%乙醇洗滌離心，加100μL TE（tris-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA）溶解。

1.2.2 外源基因的導(dǎo)入

在繁殖季節(jié)，采集高質(zhì)量的卵子和精子進(jìn)行人工受精，利用外源基因的導(dǎo)入技術(shù)，將未經(jīng)遺傳修飾的鱖基因組DNA 導(dǎo)入鏡鯉受精卵的核區(qū)附近，注射量為1nL 左右。共導(dǎo)入2500 余粒鏡鯉受精卵，孵出仔魚(yú)1500 余尾，放入池塘300 尾正常飼養(yǎng)。

1.2.3 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉DNA 提取

取新鮮的鰭條，盡量剪碎裝入1.5mL 離心管中，加入裂解液，消化，等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液抽提，預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀，TE 溶解。具體實(shí)驗(yàn)魚(yú)DNA 提取參見(jiàn)閆學(xué)春[21]。

1.2.4 AFLP 反應(yīng)體系的建立

1.2.4.1 酶切連接

本實(shí)驗(yàn)選用了兩種酶Mse I 和EcoR I 的酶切組合研究酶切效果。酶切總體系20μL，其中10×Buffer 2μL，BSA 0.2μL，模板DNA 400ng，Mse I 0.5μL，EcoR I 0.5μL，補(bǔ)ddH2O 至終體積20μL，混勻，37℃水浴2h，65℃滅活20min，終止酶切反應(yīng)，冰浴。連接體系：在裝有酶切產(chǎn)物的離心管中，依次加入Mse I 接頭1μL、EcoR I 接頭1μL、T4-DNA 連接酶0.5μL、連接酶Buffer 1μL，補(bǔ)ddH2O 至終體積30μL。過(guò)夜連接。

1.2.4.2 預(yù)擴(kuò)增

在加有1μL 連接產(chǎn)物的試管中加入EcoRⅠ引物1μL、Mse I 引物1μL、Taq DNA 聚合酶0.1μL 和Buffer 14.4μL，加水至20μL?；靹蚝螅慈缦翽CR 擴(kuò)增 條 件：94℃變 性30s，56℃退 火1min，72℃延 伸1min，20 個(gè)循環(huán)，完成循環(huán)后再延伸6min（72℃）。

1.2.4.3 選擇性擴(kuò)增

建立25μL 選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系：加入稀釋10 倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1μL、MseⅠ選擇擴(kuò)增引物1μL、EcoRⅠ選擇擴(kuò)增引物1μL、Taq DNA 聚合酶0.3μL 和Buffer 18μL，加水至25μL?；靹蚝?，按如下PCR 條件擴(kuò)增：94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，進(jìn)行36 個(gè)循環(huán)，其中13 個(gè)循環(huán)后，每個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度降低0.7℃。

表1 AFLP 接頭及引物序列Tab.1 Adapters and primers sequences of AFLP

1.2.4.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

選擇擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（去離子甲酰胺98%、10 mmol/L EDTA、0.25%溴酚藍(lán)和0.25%二甲苯青），混勻，94℃變性10min 后，立刻冰浴冷卻待用。取5μL 變性后的樣品，6%的變性聚丙烯酰胺凝電泳檢測(cè)，55W 恒定功率電泳，電泳約2.5h。取下膠板固定，銀染[22，23]，照相，分析。

1.2.4.5 目的條帶回收測(cè)序

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將差異性條帶回收，測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉基因組DNA 提取

采用酚/氯仿混合提取方法提取的顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉基因組DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，基因組DNA 條帶清晰無(wú)彌散。DNA 定量分析儀分析表明，提取的基因組DNA 的OD260/OD280均在1.8～2.0 之間，表明蛋白質(zhì)、RNA 等雜質(zhì)含量極少，提取的顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉基因組DNA 純度高，符合AFLP 的后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求[24]（圖1）。

2.2 AFLP 擴(kuò)增結(jié)果

利用引物E-AGG，M-CTA，對(duì)顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉基因組DNA 進(jìn)行AFLP 檢測(cè)，以鱖基因組DNA 為陽(yáng)性對(duì)照，普通鏡鯉基因組DNA 為陰性對(duì)照。在A(yíng)FLP 的15 對(duì)引物中，在顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉中有3 對(duì)引物均擴(kuò)增出了供體鱖基因片段，在基因水平上驗(yàn)證了在受體親本的基因組中已整合了供體鱖基因片段（表1、圖2）。

2.3 產(chǎn)物回收測(cè)序結(jié)果

為進(jìn)一步找到遺傳證據(jù)，將與鱖相同的AFLP條帶進(jìn)行切下、回收、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，供體鱖片段序列與顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉片段序列完全一致（圖3）。

3 討論

AFLP 是第三代分子標(biāo)記技術(shù)，綜合了限制性酶切片段多樣性（RFLP）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的優(yōu)點(diǎn)，分析結(jié)果靈活性高，穩(wěn)定可靠，多態(tài)性豐富，不需要預(yù)知基因組的序列特征，適用于任何來(lái)源和各種復(fù)雜度的DNA[25]。自AFLP 技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，已廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)分析、遺傳分析、指紋多態(tài)性和外源基因檢測(cè)等方面。王朝溪等[26]利用AFLP 技術(shù)分析了青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii 群體間的遺傳差異，構(gòu)建了其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性的指紋圖譜，研究結(jié)果為青海湖裸鯉的多樣性檢測(cè)和親本選育提供了可靠的技術(shù)參數(shù)，對(duì)青海湖裸鯉資源庫(kù)積累具有指導(dǎo)意義。嚴(yán)駿驄等[27]運(yùn)用AFLP 技術(shù)從3 個(gè)層面分析了鰱Hypophthalmichthys molitrix 的土著群體、中國(guó)土著群體內(nèi)和海外移居群體的遺傳格局，結(jié)果表明3 個(gè)群體間的分化表現(xiàn)顯著，為鰱的種質(zhì)資源利用、保護(hù)和管理積累了基礎(chǔ)資料。王志勇等[28]分析了官井洋大黃魚(yú)Larimichthys crocea 指紋多態(tài)性的AFLP，為大黃魚(yú)種質(zhì)優(yōu)化提供了依據(jù)。Young 等[29]構(gòu)建了虹鱒Oncorhynchus mykiss 遺傳連鎖圖譜，利用476 個(gè)AFLP 分子標(biāo)記進(jìn)行了遺傳連鎖分析，得到主連鎖群32 個(gè)，小連鎖群11 個(gè)。佟廣香等[30]報(bào)道了利用AFLP 技術(shù)檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因鯉Cyprinus carpio，證明了與生態(tài)安全直接相關(guān)的是轉(zhuǎn)基因鯉逃逸的數(shù)量。閆學(xué)春等[16]報(bào)道了通過(guò)AFLP 的檢測(cè)與分析，驗(yàn)證了河蟹Eriocheir sinensi 總DNA 可通過(guò)顯微介導(dǎo)方式整合到鏡鯉基因組中，這與本研究結(jié)果一致。本研究建立了顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的AFLP 反應(yīng)體系，適合本研究顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的鑒定，其原理是先通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶將顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的基因組DNA 雙酶切后，再通過(guò)將特定的接頭鏈接在其分子量大小不等的限制性酶切片段的兩端，對(duì)鏈接有特定接頭的片段進(jìn)行擴(kuò)增，先進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，再進(jìn)行選擇擴(kuò)增，因變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率較高，所以對(duì)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，通過(guò)條帶的多少，而獲得DNA 的多態(tài)性，進(jìn)而尋找實(shí)驗(yàn)所需要的特異條帶，再通過(guò)電泳圖譜查找是否含有供體基因片段。如果有供體基因片段，就證明了受體基因組中已成功整合了供體基因片段，其結(jié)果證明了AFLP 方法是檢測(cè)顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉的有效工具[31，32]。

利用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將異源DNA 直接導(dǎo)入魚(yú)類(lèi)進(jìn)行分子育種，可以豐富魚(yú)類(lèi)遺傳基礎(chǔ)，擴(kuò)大變異類(lèi)型，將傳統(tǒng)育種中難以利用的遠(yuǎn)緣基因轉(zhuǎn)移，為傳統(tǒng)育種提供新的種質(zhì)，對(duì)魚(yú)類(lèi)育種工作有實(shí)踐意義[33，34]。鏡鯉和鱖在分類(lèi)學(xué)上屬于兩個(gè)不同目，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種，通過(guò)常規(guī)的育種方法很難進(jìn)行雜交，主要受生物種間隔離限制而顯示了其不可回避的局限性，但通過(guò)顯微介導(dǎo)的方式將鱖基因組DNA 導(dǎo)入受體鏡鯉基因組中，可以克服常規(guī)雜交選育方法中各種雜交不親和性障礙，因此，顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)在創(chuàng)造魚(yú)類(lèi)新品種、新類(lèi)型方面存在著巨大的應(yīng)用前景。而利用鱖良好的遺傳資源，再結(jié)合顯微介導(dǎo)的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將這些有益的基因?qū)胧荏w魚(yú)中，就有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)受體魚(yú)的改良。本研究通過(guò)AFLP 指紋圖譜分析，在顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉中檢測(cè)到了鱖的特異片段，這從DNA 水平上證實(shí)了鱖的部分基因片段已滲入到顯微介導(dǎo)鱖基因鏡鯉親本基因組中，說(shuō)明了鱖總DNA導(dǎo)入受體鏡鯉獲得成功。轉(zhuǎn)基因是隨機(jī)插入，至于是哪部分基因插入到受體基因組中，發(fā)揮著什么作用，還有待進(jìn)一步研究。本研究是兩個(gè)基因組之間的雜交，盡管所滲入的供體基因組基因沒(méi)有轉(zhuǎn)目標(biāo)基因那么明確，但只要能使受體親本的目標(biāo)性狀達(dá)到改良的目的，就對(duì)鯉科魚(yú)類(lèi)的肌肉品質(zhì)改良具有重要有意義[13]。