呂翠翠， 李 新，李 青，穆 娟，王 嘉，袁 婷，江嫣雨，鄧 琦

(天津市第一中心醫(yī)院 血液科，天津 300192)

費(fèi)城染色體(Philadelphia chromosome, Ph)陽(yáng)性急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)占成人急性淋巴細(xì)胞白血病總發(fā)病率的20%～30%。酪氨酸激酶抑制劑 (tyrosine kinase inhibitors, TKIs) 的問(wèn)世顯著提高了Ph陽(yáng)性(Ph+)ALL患者的療效[1-3]。然而，難治及復(fù)發(fā)是Ph+ALL患者面臨的主要問(wèn)題。近年來(lái)，嵌合抗原受體修飾(chimeric antigen receptor, CAR)T細(xì)胞治療在難治/復(fù)發(fā)性急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)中表現(xiàn)出前所未有的療效。TKIs可在體外及小鼠體內(nèi)抑制CAR-T細(xì)胞的增殖和殺傷活性[4]，但臨床中TKIs與CD19 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用，TKIs是否抑制后者的功能而影響療效，目前尚不清楚。本研究利用CD19 CAR-T細(xì)胞治療難治/復(fù)發(fā)Ph+ALL，同時(shí)給予TKIs口服，研究TKIs是否會(huì)影響CD19 CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增、療效及不良反應(yīng)。

1 資料與方法

1.1病例選擇 收集2018年4月至2019年10月在我院確診的10例難治/復(fù)發(fā)Ph+ALL患者及16例難治/復(fù)發(fā)Ph陰性B-ALL患者，根據(jù)是否添加TKIs分為兩組，TKIs組10例，男7例，女3例，中位年齡54(33，66)歲，臨床資料見(jiàn)表1；非TKIs組16例，男9例，女7例，中位年齡27(15，50)歲。研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本的采集經(jīng)所有研究對(duì)象知情同意并簽署知情同意書(shū)，以難治/復(fù)發(fā)B-ALL入組我院“人源化CD19 CAR-T治療復(fù)發(fā)/難治B細(xì)胞淋巴瘤/急性B淋巴細(xì)胞白血病”臨床試驗(yàn)(ChiCTR1800019622)。

表1 10例難治/復(fù)發(fā)Ph+ ALL患者的臨床特征

1.2收集臨床資料 包括性別、年齡、輸注CAR-T細(xì)胞時(shí)外周血白細(xì)胞數(shù)和流式骨髓原始細(xì)胞比例、免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志、BCR/ABL激酶類型、服用TKIs種類、BCR/ABL激酶區(qū)突變類型、造血干細(xì)胞移植情況及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累情況等。

1.3CD19 CAR-T細(xì)胞制備及輸注 收集患者的單采外周血，使用淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，使用磁珠分選試劑盒從提取的單個(gè)核細(xì)胞中富集CD3+T細(xì)胞，并用CD3/CD28磁珠擴(kuò)增CD3+T細(xì)胞，獲得的細(xì)胞用含有白細(xì)胞介素(IL)-2、谷氨酰胺的T細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)第4天使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)體系中無(wú)CD19陽(yáng)性白血病細(xì)胞殘留后，轉(zhuǎn)染含有抗CD19-CAR序列的慢病毒，培養(yǎng)第5天采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD19 CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，培養(yǎng)第12天收獲CAR-T細(xì)胞。在輸注CD19 CAR-T細(xì)胞的前4天至前2天給予患者FC方案[F：氟達(dá)拉濱30 mg/(m2·d)，C：環(huán)磷酰胺300 mg/(m2·d)，共3天]進(jìn)行淋巴細(xì)胞清除預(yù)處理， 然后輸注CD19 CAR-T細(xì)胞1×106/kg。

1.4TKIs口服治療 自外周血單個(gè)核細(xì)胞采集日起，TKIs組給予TKIs口服，其中伊馬替尼400 mg，1次/d；達(dá)沙替尼50～70 mg，2次/d；普納替尼45 mg，1次/d。

1.5CD19 CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增 分別在CD19 CAR-T細(xì)胞輸注后第0天、4天、7天、14天、21天以及28天用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組外周血中CD19 CAR-T細(xì)胞的比例。

1.6CD19 CAR-T細(xì)胞輸注的不良反應(yīng)監(jiān)測(cè) 分別在CD19 CAR-T細(xì)胞輸注后第0、4、7、14、21及28天用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)兩組外周血中細(xì)胞因子IL-6、IL-2R、IL-8、IL-10及腫瘤壞死因子α (TNF-α)水平。根據(jù)文獻(xiàn)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]，進(jìn)行細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome, CRS)分級(jí)評(píng)定。

1.7療效評(píng)價(jià) 在CD19 CAR-T細(xì)胞輸注后14天評(píng)估治療反應(yīng)，治療反應(yīng)包括完全緩解(complete response, CR)、完全緩解伴血細(xì)胞不完全恢復(fù)(CR with incomplete count recovery, CRi)和無(wú)緩解(no remission, NR)。TKIs組于輸注CAR-T細(xì)胞后每月檢測(cè)BCR/ABL定量。本研究隨訪至2020年5月31日或患者死亡，比較兩組總生存率(overall survival, OS)和無(wú)病生存率(disease free survival, DFS)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))[M (Q1，Q3)]表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；等級(jí)資料比較采用Mann-whitney秩和檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法計(jì)算OS和DFS，組間差異采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料 與非TKIs組相比，TKIs組年齡更大，高危細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志更多，但兩組在性別、輸注CAR-T細(xì)胞時(shí)外周血白細(xì)胞數(shù)和流式骨髓原始細(xì)胞比例、免疫分型、造血干細(xì)胞移植及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組臨床特征比較

2.2CD19 CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率和輸注情況 TKIs組和非TKIs組CD19 CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率均值分別為55.96%和57.43%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.518，P=0.269)。TKIs組和非TKIs組輸注CD19 CAR-T細(xì)胞的均值分別為(1.08±0.02)×106/kg和(1.10±0.03)×106/kg，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.957，P=0.328)。

2.3CD19 CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增情況 兩組外周血中CD19 CAR-T細(xì)胞峰值均出現(xiàn)在輸注后第7～14天，在輸注14天以后逐漸下降。TKIs組外周血中CD19 CAR-T細(xì)胞峰值為41.80%(25.19%, 65.14%)，非TKIs組外周血中CD19 CAR-T細(xì)胞峰值為14.80%(3.32%, 33.74%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.220，P=0.0037), 見(jiàn)圖1。

2.4兩組細(xì)胞因子比較 兩組細(xì)胞因子在輸注CD19 CAR-T細(xì)胞后第4～14天升至峰值，第14天以后逐漸下降。兩組細(xì)胞因子峰值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

2.5兩組不良反應(yīng)比較 TKIs組CRS為1～4級(jí)，其中1級(jí)30%(3/10)，2級(jí)30%(3/10)，3級(jí)30%(3/10)，4級(jí)10%(1/10)。非TKIs組CRS為1～3級(jí)，其中1級(jí)62.5%(10/16)，2級(jí)18.75%(3/16)，3級(jí)18.75%(3/16)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.135)，見(jiàn)圖3。

2.6隨訪及療效觀察短期療效 TKIs組CD19 CAR-T治療后第14天均達(dá)CR/CRi；非TKIs在CD19 CAR-T治療后第14天，CR率為75%(12/16)，NR率為25%(4/16)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.136)。TKIs組在輸注后1個(gè)月BCR/ABL融合基因定量均為0。遠(yuǎn)期療效：非TKIs組有5例患者行異基因造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)。至隨訪截止日期，中位隨訪時(shí)間為8個(gè)月，TKIs組中位OS時(shí)間為10.0個(gè)月，非TKIs未移植組中位OS時(shí)間為6.0個(gè)月，非TKIs

移植組尚未獲得中位OS，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.746；P=0.418)。TKIs組中位DFS時(shí)間為8.0個(gè)月，非TKIs未移植組中位DFS時(shí)間為4.0個(gè)月，非TKIs移植組尚未獲得中位DFS，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.644；P=0.440)，見(jiàn)圖4。

3 討 論

在TKIs問(wèn)世以前，Ph+ALL患者易復(fù)發(fā)、緩解期短、預(yù)后差。隨著TKIs的應(yīng)用，Ph+ALL的療效顯著提升。然而，難治/復(fù)發(fā)仍是Ph+ALL亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。TOGASAKI等報(bào)道發(fā)現(xiàn)，HSCT能顯著降低Ph+ALL復(fù)發(fā)率[6]。當(dāng)前，對(duì)于難治/復(fù)發(fā)Ph+ALL患者，異基因HSCT仍是首選治療方式。然而，由于高齡或缺乏供者，部分患者沒(méi)有條件進(jìn)行異基因HSCT。

CAR-T細(xì)胞是通過(guò)基因工程改造的T淋巴細(xì)胞，能特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞[7]。CAR-T治療使B-ALL的療效大大改善， 其中CD19 CAR-T在成人及兒童難治復(fù)發(fā)性CD19+ALL的完全緩解率在70%～90%[8-12]。因此，CAR-T是沒(méi)有移植條件的難治/復(fù)發(fā)Ph+ALL患者的新的治療選擇。本研究收集了10例難治/復(fù)發(fā)Ph+ALL患者的臨床資料，其中8例患者因高齡或缺乏供者無(wú)法行異基因HSCT， 另2例患者行異基因HSCT后復(fù)發(fā)，故10例患者均選擇CD19 CAR-T治療，同時(shí)給予TKIs口服。

研究表明，TKIs達(dá)沙替尼在體外及小鼠體內(nèi)能抑制CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和殺傷活性，去除達(dá)沙替尼后，CAR-T細(xì)胞的增殖和殺傷活性可以恢復(fù)，因此達(dá)沙替尼對(duì)CAR-T細(xì)胞起到“開(kāi)關(guān)”的作用[4]。在臨床實(shí)踐中，選擇CD19 CAR-T治療的Ph+ALL患者一般會(huì)常規(guī)服用TKIs，但TKIs是否抑制人體內(nèi)CD19 CAR-T的功能及療效，目前尚不清楚。本研究首次表明TKIs可以促進(jìn)CD19 CAR-T細(xì)胞在復(fù)發(fā)Ph+ALL中的擴(kuò)增。盡管與非TKIs組相比，TKIs組年齡更大，高危細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志更多，但兩組OS和DFS均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組CRS分級(jí)和細(xì)胞因子分泌水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TKIs既不抑制CAR-T的療效，也不加重其不良反應(yīng)。

在短期療效方面，盡管TKIs組與非TKIs組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TKIs組 CR率整體要高于非TKIs組。因此服用TKIs能在短期內(nèi)提高療效，與非TKIs組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)上的無(wú)差異可能是入組病例數(shù)較少的緣故。

此外，本研究結(jié)果與此前報(bào)道的TKIs在體外及小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全相反， 這可能是由于體內(nèi)外及不同物種之間環(huán)境差異造成的。CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)取決于多種內(nèi)在和外在因素，如CAR-T產(chǎn)物表型和成分、腫瘤負(fù)荷、輸注前的淋巴消耗治療等。此外，不同來(lái)源的CAR-T細(xì)胞的功能活性不同，達(dá)到同一輸注效果所需的CAR-T數(shù)量不同[12-13]。小鼠與患者以上這些因素的差異及體內(nèi)外環(huán)境的不同可能導(dǎo)致研究結(jié)果的不同。

綜上所述，本研究首次表明，TKIs促進(jìn)CD19 CAR-T細(xì)胞在復(fù)發(fā)Ph+ALL中的擴(kuò)增，不抑制CD19 CAR-T細(xì)胞的療效，不加重其不良反應(yīng)。CD19 CAR-T聯(lián)合TKIs是沒(méi)有條件行異基因HSCT的復(fù)發(fā)Ph+ALL的新的選擇，其療效顯著，安全性好。