劉秀麗 王春林 易斌 武蕓 康亞青

摘要采用乙醇提取法外加超聲波輔助，探究不同條件下黑枸杞提取液對(duì)常見致病菌（包括大腸埃希氏菌E.coli、金黃色葡萄球菌S.au、腸炎沙門氏菌S.en）的抑菌效果，并在最佳抑菌效果的提取條件下，采用DPPH法測(cè)定提取液的抗氧化能力。結(jié)果表明：超聲時(shí)間30 min，超聲頻率60 Hz，浸提溫度25 ℃，料液比1∶15（g∶mL），乙醇濃度60%時(shí)，提取液抑菌性能最佳。尤其對(duì)S.en抑菌效果最好，最低抑菌濃度為0.125 g/mL。在上述提取條件下，黑枸杞提取液對(duì)自由基的清除率隨濃度的增大而顯著增大，具有明顯的量效關(guān)系，溶液濃度在600 μg/mL以上時(shí)，黑枸杞提取物對(duì)自由基的清除率高于同濃度下的VC水溶液，最大清除率可達(dá)76.26%。說明黑枸杞浸提液具有明顯的抑菌效果和較強(qiáng)的抗氧化性。

關(guān)鍵詞黑枸杞;提取液;抑菌性;抗氧化

中圖分類號(hào)TS255文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A?文章編號(hào)0517-6611（2020）15-0180-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.052

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Antibacterial and Antioxidant Activities of Lycium ruthenicum Murr.Extracts in Minqin，Gansu Province

LIU Xiuli1，2，WANG Chunlin1，2，YI Bin1 et al

（1.University Provincial Key Laboratory for Protection and Utilization of Longdong Bioresources in Gansu，Qingyang，Gansu 745000;2.College of Life Science and Technology，Longdong University，Qingyang，Gansu 745000）

AbstractUsing ethanol extraction and ultrasonic assisted methods to explore the antibacterial effects of Lycium ruthenicum Murr. extracts under different conditions on common pathogens [including Escherichia coli（E.coli），Staphylococcus aureus（S.au），and Salmonella enteritidis（S.en）].Under the best antibacterial effect， the DPPH method is used to determine the antioxidant capacity of the extract.The results showed that when the ultrasonic time was 30 min， the ultrasonic frequency was 60 Hz， the extraction temperature was 25 ℃， the ratio of material to liquid was 1∶15（g∶mL）， and the ethanol concentration was 60%， the extract had the best antibacterial performance. In particular， it had the best antibacterial effect on S.en， with a minimum inhibitory concentration of 0.125 g/mL.Under the above extraction conditions， the scavenging rate of L. ruthenicum on free radicals increased significantly with the increase of the concentration， which had an obvious effect and dose relationship.When the solution concentration was above 600 μg/mL， the scavenging rate of L. ruthenicum extract on free radicals was higher than that of the Vc aqueous solution at the same concentration， and the maximum scavenging rate can reach 76.26%.It shows that the L. ruthenicum extract has obvious antibacterial effect and strong antioxidation.

Key wordsLycium ruthenicum Murr.;Extract;Antibacterial activity;Oxidation resistance

基金項(xiàng)目甘肅省高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目（2008A-099）;甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（18JR3RM235）;隴東學(xué)院科技創(chuàng)新項(xiàng)目（XYZK1901）;甘肅省高等學(xué)校科研項(xiàng)目（2017B-63）。

作者簡(jiǎn)介劉秀麗（1979—），女，河北承德人，副教授，碩士，從事植物學(xué)研究。

收稿日期2020-04-07;修回日期2020-04-26

黑枸杞是茄科植物黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）的果實(shí)，主要分布于中亞地區(qū)，如中國(guó)、巴基斯坦、印度等國(guó)家。該植物是多棘刺灌木，漿果紫黑色，球狀，種子腎形，褐色，花果期5—10月[1]。由于黑枸杞具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，在惡劣的荒漠環(huán)境中依然能夠頑強(qiáng)生長(zhǎng)，因此常見于鹽堿土和沙土等較為不利的土地環(huán)境中，其具有獨(dú)特的儲(chǔ)鹽機(jī)理因而對(duì)鹽堿土有改良作用，是自然界中一類兼具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益的高價(jià)值植物。在我國(guó)，黑枸杞生長(zhǎng)分布于甘肅、青海、寧夏等西北地區(qū)，其在生態(tài)修復(fù)方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)，較為繁盛的根系以及強(qiáng)大的生存能力能有效地保持水土，耐鹽堿性可發(fā)揮改善鹽堿地的作用，較強(qiáng)的光合能力以及逆境中的生存能力利于防風(fēng)固沙[2]。

除具有生態(tài)環(huán)境保護(hù)作用，黑枸杞中含量頗高的營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、礦物質(zhì)、維生素以及枸杞多糖、酚類、黃酮類等生理活性物質(zhì)，使其在藥品、保健品、食品等行業(yè)擁有較大的發(fā)展?jié)摿?。?duì)于枸杞的藥用價(jià)值，歷來有所記載，經(jīng)典的醫(yī)學(xué)著作《晶珠本草》上就記載枸杞具有治療冠心病、月經(jīng)失調(diào)等疾病的作用。近些年，越來越多的人注意到黑枸杞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中黑枸杞兼?zhèn)渌{(lán)莓的花色苷成分和紅枸杞的多糖成分，研發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域廣泛。隨著日益增長(zhǎng)的需求以及研究向縱深處擴(kuò)展，關(guān)于黑枸杞的產(chǎn)品將具有廣闊的發(fā)展空間[3]。

當(dāng)代研究表明，黑枸杞中氨基酸類型多樣，例如甲硫氨酸、苯丙氨酸等含量較高[4]。王紫薇[5]通過有機(jī)溶劑提取法研究提取液中各成分的含量以及活性，最終結(jié)果顯示黑枸杞提取液中酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)含量為45.05、56.54 mg/g，多糖成分為7.83%，VC含量為99.0 mg/kg。黑枸杞中研究最多、應(yīng)用前景最廣的物質(zhì)為花青素。目前研究證明花青素具備多種生理活性，如抗氧化、抗炎、抗心血管疾病及防癌等[6]。

該研究以甘肅民勤黑枸杞為原材料，通過檢測(cè)黑枸杞提取液對(duì)常見致病菌[包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.au）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，S.en）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）]的抑菌能力，優(yōu)化提取條件，并以自由基清除率為指標(biāo)測(cè)定提取液在該條件下的抗氧化性，以期為黑枸杞的充分利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

黑枸杞來自于甘肅省民勤縣，隨機(jī)采摘，果實(shí)均在40～45 ℃烘干24 h，再于45～50 ℃下烘至恒重。致病菌來源：由慶陽(yáng)市疾控中心實(shí)驗(yàn)室提供并于隴東學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2儀器與試劑

立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、超凈化工作臺(tái)（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)公司）;冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、VC、DPPH、無水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1抑菌性分析。

參照前人[7]研究，制作帶有細(xì)菌培養(yǎng)基的方法為傾注法，即在50 ℃左右的固體培養(yǎng)基中加入一定量預(yù)先活化的菌液，充分振蕩混合均勻后立即倒平板，倒好的平板正置等待凝固;在平板上打孔后向孔中加入定量的無菌提取液，之后將培養(yǎng)基置于4 ℃冰箱中預(yù)擴(kuò)散2 h形成擴(kuò)散圈，37 ℃培養(yǎng)后觀察。

1.3.2黑枸杞提取液浸提條件的優(yōu)化。

該試驗(yàn)采用有機(jī)溶劑外加超聲波輔助法浸提黑枸杞，以有機(jī)溶劑45%、60%、75%乙醇為梯度，料液比1∶10、1∶15、1∶20（g∶mL），提取溫度25、40、55、70 ℃，超聲頻率40、50、60、70 Hz，提取時(shí)間10、20、30、40、50 min等，獲取枸杞浸提液，對(duì)致病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，通過抑菌效果及單因素及正交試驗(yàn)分析，篩選黑枸杞抑菌成分的最優(yōu)提取方法。

1.3.3提取液最低抑菌濃度及抑菌持續(xù)時(shí)間測(cè)定。

確定最佳提取條件后，采用二倍稀釋法對(duì)提取液進(jìn)行稀釋，分別對(duì)常見致病菌S.au、S.en、E.coli進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，觀察并測(cè)量抑菌圈大小、持續(xù)時(shí)間及最低抑菌濃度。

1.3.4黑枸杞提取物抗氧化性分析。

DPPH是一種在體外非常穩(wěn)定的具有較深顏色的自由基，黑枸杞提取液中的某些物質(zhì)可捕獲DPPH進(jìn)而使溶液顏色變化，這種變化可通過分光光度計(jì)被量化，因此DPPH常被用于溶液抗氧化性的檢測(cè)[8]。該試驗(yàn)參照藺瑞等[9]的方法，將黑枸杞提取物、VC配制成2.0 mg/mL的溶液，DPPH溶液濃度為0.4 mg/mL，并在暗處保存。溶液配制完成后，取5支試管，按表1所示快速加入相應(yīng)溶液。之后在避光黑暗處放置 30 min充分反應(yīng)，此為試驗(yàn)組。將DPPH溶液替換為等量的無水乙醇作為空白組，對(duì)照組將待測(cè)液替換為等量的無菌水，迅速在517 nm 處測(cè)定吸光值，之后再做2組平行對(duì)照。以平均值作為結(jié)果按下式計(jì)算清除率：

清除率= [A1-（A2-A3）] /A3×100%

式中，A1為對(duì)照組的吸光值;A2為試驗(yàn)組的吸光值;A3為空白組的吸光值。

1.3.5數(shù)據(jù)處理。

所有試驗(yàn)均采用3組平行對(duì)照，使用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2結(jié)果與分析

2.1黑枸杞提取液浸提條件的優(yōu)化

通過在不同梯度乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、超聲頻率、提取溫度下獲取黑枸杞提取液，根據(jù)抑菌圈大小及抑菌時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素分析，結(jié)果表明超聲時(shí)間30 min，超聲頻率60 Hz，浸提溫度25 ℃，料液比1∶15，乙醇濃度60%時(shí)，提取液抑菌性能最佳。

2.2提取液最低抑菌濃度及抑菌時(shí)間測(cè)定

2.2.1提取液最低抑菌濃度測(cè)定。

確定抑菌效果最佳的提取條件后，制備終濃度為1 g/mL的無菌提取液，以二倍稀釋法分別獲得濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5的濾菌提取液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，記錄提取液對(duì)S.au、S.en、E.coli的抑菌效果。由表2可知，提取液對(duì)S.au、S.en、E.coli的最低抑菌濃度分別為0.25、0.125、0.5 g/mL，對(duì)S.au和S.en的抑菌圈直徑隨著提取液濃度的降低而顯著降低，說明提取液濃度對(duì)抑菌性能具有顯著性的影響。在相同提取條件下，相對(duì)于其他2種菌，提取液對(duì)S.en的抑菌效果最佳，上述病菌對(duì)提取液敏感性的大小依次是S.en>S.au>E.coli。

2.2.2抑菌持續(xù)時(shí)間測(cè)定。

在上述研究基礎(chǔ)上，記錄提取液對(duì)S.au、S.en、E.coli的抑菌持續(xù)時(shí)間。由表3可知，在相同初始濃度提取液作用下，對(duì)S.au、S.en抑菌持續(xù)時(shí)間相當(dāng)，對(duì)E.coli抑菌作用時(shí)間較短，隨著提取液濃度降低，抑菌圈持續(xù)時(shí)間皆顯著縮短直至失去抑菌作用，但對(duì)比結(jié)果表明，黑枸杞提取液對(duì)S.au具有更強(qiáng)的作用效果。

2.3提取液抗氧化測(cè)定

以新鮮干黑枸杞為材料，用上述方法獲得提取液，以VC水溶液為對(duì)照進(jìn)行抗氧化研究，由表4可知，黑枸杞提取液對(duì)自由基的清除率隨濃度的增大而顯著增大，具有明顯的量效關(guān)系，當(dāng)濃度高于600 μg/mL時(shí)，提取液對(duì)自由基的清除率高于同濃度下的VC，最大清除率可達(dá)76.26%。綜合比較可知，黑枸杞提取物具備較強(qiáng)的抗氧化活性。

3討論

劉如運(yùn)[10]采用多種方法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，最終得出結(jié)論：用涂布法制備含菌平板、平板打孔法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)效果較好。該試驗(yàn)實(shí)際操作過程中，采用涂布法制備含菌平板雖然操作簡(jiǎn)單，但在后續(xù)操作過程中發(fā)現(xiàn)，平板上的細(xì)菌容易生長(zhǎng)不均勻，細(xì)菌或成片成片長(zhǎng)成菌苔或零零落落非常稀疏，這會(huì)對(duì)抑菌圈大小判斷造成巨大誤差，且試驗(yàn)重復(fù)性差。采用傾注法獲得含有細(xì)菌的平板，只要注意控制溫度，勿使加入的細(xì)菌被燙死，充分振蕩，即可制備良好的含菌平板。對(duì)于抑菌試驗(yàn)，平板打孔法簡(jiǎn)便快速，易于觀察，效果良好。此試驗(yàn)選擇的3種供試菌是生活中容易接觸到的胃腸道病菌，所以用這些菌種作為抑菌對(duì)象具有廣泛的實(shí)際價(jià)值，提取液擴(kuò)散形成的抑菌圈直接簡(jiǎn)單地展示了對(duì)細(xì)菌的抑菌性能。高春燕等[11]得出，對(duì)于E.coli、S.au，枸杞多糖對(duì)它們的抑菌效果無顯著性差異。在該試驗(yàn)中，對(duì)E.coli、S.au的抑菌圈卻具有明顯差異，說明枸杞提取液中不僅存在多糖這種抑菌物質(zhì)，而且存在其他相關(guān)生理活性成分，其對(duì)E.coli也具有抑菌性。關(guān)于黑枸杞提取液的抗菌機(jī)制，相關(guān)資料研究表明具有兩種可能性，其一為枸杞提取液中枸杞多糖含量豐富，這些多糖結(jié)合在菌體表面后，一方面快速地打破細(xì)菌屏障結(jié)構(gòu)，如最外層的細(xì)胞壁以及柔韌的細(xì)胞膜，進(jìn)而使細(xì)菌內(nèi)物質(zhì)外流而死亡，另一方面阻擋營(yíng)養(yǎng)物、相關(guān)代謝產(chǎn)物正常進(jìn)入菌體內(nèi)，使細(xì)菌因不能吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而“渴死”或進(jìn)入休眠狀態(tài)，最終達(dá)到抑菌的目的[12]。其二是枸杞提取液中的生理活性物質(zhì)如甜菜堿以及單寧類、酚酸類、黃酮類物質(zhì)具有使細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白失活的作用，之后其他物質(zhì)可以結(jié)合細(xì)菌的DNA，在遺傳水平上改變細(xì)菌的生理性狀，抑菌細(xì)菌生長(zhǎng)[13]。

枸杞提取液抗氧化性測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)溶液濃度高于600 μg/mL時(shí)，黑枸杞提取液對(duì)DPPH自由基的清除率要明顯高于VC水溶液。研究表明，枸杞中富含多酚、枸杞多糖、花青素等活性成分。黑枸杞被稱為“軟黃金”的原因之一是枸杞中的花青素是所有植物花青素中功效最佳的。從本質(zhì)上來說，花青素是一種對(duì)自由基親和力強(qiáng)、反應(yīng)迅速、抗氧化效果顯著的化學(xué)物質(zhì)，它具備清除對(duì)人體具有氧化損傷作用的氧自由基、羥基自由基等作用[14]。推測(cè)花青素可能是黑枸杞抗氧化能力的主要來源。

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