王東權(quán) 劉麗 安博洋 李波

摘要通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法對3種鶇科（Turdidae）鳥類赤頸鶇（Turdus ruficollis）、紅尾鶇（Turdus naumanni）、斑鶇（Turdus eunomus）進(jìn)行性別鑒定。以CHD基因性別鑒定為基準(zhǔn)，討論形態(tài)學(xué)與微衛(wèi)星性別鑒定的準(zhǔn)確率與可行性。結(jié)果表明，3種鶇科鳥類中赤頸鶇能夠通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行性別鑒定，其準(zhǔn)確率為0.89%;紅尾鶇與斑鶇的性別鑒定準(zhǔn)確率僅為0.57%和0.38%，無法通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行有效的性別鑒定。形態(tài)學(xué)性別鑒定存在局限性，受鳥類年齡、季節(jié)、地區(qū)的影響明顯，并且對個體特征不清晰或個體殘缺樣本不能進(jìn)行有效鑒定。此次試驗中99只個體僅73只具有完整形態(tài)，剩余個體只能通過分子生物學(xué)方法進(jìn)行性別鑒定。微衛(wèi)星鑒定與CHD基因性別鑒定結(jié)果存在不一致的現(xiàn)象，總體準(zhǔn)確率僅0.88%，且鑒定錯誤的12只個體均是將雄性鑒定為雌性，原因可能是該微衛(wèi)星位點跨物種使用時與性別連鎖度降低。相較于微衛(wèi)星鑒定需要毛細(xì)管電泳分型，CHD基因性別鑒定方法只需要對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，該鑒定方法更簡便、成本更低。

關(guān)鍵詞鶇科鳥類;性別鑒定;形態(tài)學(xué);微衛(wèi)星;CHD基因

中圖分類號Q953文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2020）15-0092-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Sex Identification of Three Species of Turdidae

WANG Dongquan，LIU Li，AN Boyang et al

（College of Wildlife and Protected Area，Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang ?150040）

AbstractThe genders of three species of Turdidae birds（Turdus ruficollis， Turdus naumanni， and Turdus eunomus）were identified by morphological and molecular biological methods. Based on the sex identification of CHD?gene， the accuracy and feasibility of morphological and microsatellite sex identification were discussed. The results showed that the red necked thrush could be identified by morphology with an accuracy of 0.89%， while the red tailed thrush and spotted thrush with an accuracy of only 0.57% and 0.38%， which could not be identified by morphology. There were limitations in morphological sex identification， which was obviously affected by the age， season and region of birds， and for the individual characteristics were not clear or individual incomplete samples could not be effectively identified. Only 73 of the 99 birds in this experiment had complete morphology， and the rest could only be identified by molecular biological methods. The results of microsatellite identification and sex identification of CHD?gene were inconsistent， the overall accuracy was only 0.88%， and the 12 birds identified incorrectly were all male samples identified as female， which might be due to the decrease of sex linkage when the microsatellite site was used across species. Microsatellite identification needed capillary electrophoresis typing. While the CHD?gene identification method only needed agarose gel electrophoresis for the amplified products. This method was simpler and cheaper.

Key wordsTurdidae birds;Sex identification;Morphology;Microsatellite;CHD?gene

基金項目中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（2572018BE04）。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)鑒定

經(jīng)文獻(xiàn)分析得到3種鶇科鳥類的形態(tài)學(xué)性別鑒定標(biāo)準(zhǔn)（表1），據(jù)此對99只鶇科鳥類進(jìn)行性別鑒定。在鑒定過程中發(fā)現(xiàn)26只個體有殘缺，其中赤頸鶇2只，紅尾鶇20只，斑鶇4只，這些樣本無法通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行性別鑒定。其余73只個體可進(jìn)行形態(tài)學(xué)性別鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35只赤頸鶇雌性18只、雄性17只;30只紅尾鶇雌性22只、雄性8只;8只斑鶇雌、雄各4只。

2.2微衛(wèi)星鑒定

經(jīng)微衛(wèi)星電泳分型，結(jié)果有9個等位基因，其基因頻率分別為282（0.020）、284（0.101）、286（0348）、288（0.237）、290（0.126）、292（0.136）、294（0020）、296（0005）、302（0.005）。電泳結(jié)果中雌性個體等位基因為1，基因型為純合;雄性個體等位基因數(shù)為2，基因型為雜合（圖1）。據(jù)此得出3種鶇科鳥類性別鑒定結(jié)果：37只赤頸鶇雌性20只，雄性17只;50只紅尾鶇雌性31只，雄性19只;12只斑鶇樣本雌性5只，雄性7只。

圖1紅尾鶇雌雄個體毛細(xì)管電泳結(jié)果

Fig.1Capillary electrophoresis results of male and female individuals of Turdus naumanni

2.3CHD基因鑒定

從CHD基因性別鑒定電泳結(jié)果（圖2）可以看出，3種鶇科鳥類的雄性個體都是1條條帶（CHD-Z，約350 bp），而雌性個體則是2條條帶（CHD-Z與CHD-W，分別約350和400 bp）。99只個體的PCR產(chǎn)物電泳檢驗后均得到清晰的性別鑒定結(jié)果，其中37只赤頸鶇雌性18只、雄性19只;50只紅尾鶇雌性24只、雄性26只;12只斑鶇樣本雌性2只、雄性10只。

3數(shù)據(jù)處理

以CHD基因鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計算得到鶇科鳥類形態(tài)學(xué)性別鑒定與微衛(wèi)星性別鑒定的準(zhǔn)確率（表2）。由表2可知，赤頸鶇的準(zhǔn)確率最高，達(dá)到0.89%;紅尾鶇次之，為0.57%;斑鶇的準(zhǔn)確率最低，僅為0.38%。微衛(wèi)星性別鑒定的準(zhǔn)確率都較高：赤頸鶇最高，為0.95%，紅尾鶇次之，為0.86%，斑鶇準(zhǔn)確率最低，為0.75%。微衛(wèi)星鑒定結(jié)果中所有雌性個體準(zhǔn)確率為100%，僅12只雄性鑒定結(jié)果出現(xiàn)誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確率下降，但微衛(wèi)星性別鑒定準(zhǔn)確率較高，不低于0.70%。

4討論

自1995年CHD基因被應(yīng)用于鳥類性別鑒定以來，CHD基因已成為突胸鳥類性別鑒定最重要的分子標(biāo)記，也是目前鳥類性別鑒定應(yīng)用最廣泛的方法之一[22]。田秀華等[12]和劉鑄等[13]通過CHD基因?qū)|方白鸛（Ciconia boyciana）及7種鶴形目鳥類進(jìn)行有效的性別鑒定;沈瑋等[23]通過CHD基因?qū)Φ燮簌Z（Aptenodytes forsteri）進(jìn)行性別鑒定，并對該方法進(jìn)行分析討論;張延君[24]對疣鼻天鵝（Cygnus olor）成功進(jìn)行性別鑒定，并做了引物優(yōu)化。蘇倡等[25]對6種來自柳鶯科（Phylloscopidae）、鹡鸰科（Motacillidae）、巖鷚科（Prunellidae）的雀形目鳥類的CHD基因性別鑒定方法做了有效性評估。此外，利用CHD基因?qū)Π槪‥gretta garzetta）、鴿子（Columba）、雞（Gallus gallus domesticus）等多種鳥類都進(jìn)行了有效的性別鑒定[26-28]。該研究發(fā)現(xiàn)，CHD基因的通用引物P2/P8可以對3種鶇科鳥類進(jìn)行準(zhǔn)確、有效的性別鑒定。

該研究的99只鶇科鳥類均為司法鑒定送檢的死體，由于個體殘缺等原因?qū)е?6只無法進(jìn)行形態(tài)學(xué)性別鑒定。保存完好的73只個體的形態(tài)學(xué)性別鑒定結(jié)果顯示，3種鶇科鳥類中赤頸鶇雌雄性別鑒定準(zhǔn)確率都較高（>80%）。紅尾鶇的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果整體偏低，且雌性的鑒定準(zhǔn)確率明顯高于雄性的。這主要是由于該研究中紅尾鶇形態(tài)性別鑒定結(jié)果偏向雌性，導(dǎo)致雌性準(zhǔn)確率偏高，雄性準(zhǔn)確率偏低。斑鶇形態(tài)學(xué)性別鑒定整體準(zhǔn)確率最低，其雌雄鑒定準(zhǔn)確率為0和043%，推測是由于形態(tài)學(xué)特征不能對斑鶇進(jìn)行有效的性別鑒定的同時，鑒定樣本數(shù)量過少（斑鶇為8只）。綜上所述，該研究中僅赤頸鶇能通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行有效的性別鑒定，紅尾鶇與斑鶇不能通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行性別鑒定。由于鳥類形態(tài)特征受鳥類年齡，季節(jié)以及生存環(huán)境影響很大[29]，該試驗所有樣本均為秋季送檢的冷凍樣本，死亡時間可能為換羽的時期[30]，所以紅尾鶇與斑鶇的形態(tài)學(xué)鑒定準(zhǔn)確率偏低。運輸與冷凍保存等人為因素也對鳥類的形態(tài)特征造成一定程度的破壞，降低了形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性[31]。此外，也存在個體形態(tài)特征缺失或雌雄特征之間重疊的情況[32]，很難準(zhǔn)確進(jìn)行性別鑒別。推測可能是由于鳥類種間雜交導(dǎo)致個別鶇科鳥類形態(tài)學(xué)特征為雜交親本中間型[19，33]，所以特征比較模糊難以鑒定，這就要求鑒定人員有豐富的經(jīng)驗[2]，而且需要多人參與鑒定以減少主觀性帶來的偏差[16]。

以CHD基因鑒定結(jié)果為基準(zhǔn)，微衛(wèi)星性別鑒定方法的整體準(zhǔn)確率較高，僅12只雄性鳥類鑒定結(jié)果出現(xiàn)錯誤。推測可能是因為微衛(wèi)星基因座來自烏鶇物種[9]，與該試驗的3種鶇科鳥類性別連鎖程度降低，或是受到個體雜交與變異的影響，導(dǎo)致雜合樣本鑒定結(jié)果為純合[34]。3種鶇科鳥類中斑鶇微衛(wèi)星性別鑒定總準(zhǔn)確率最低，為0.75，依然能夠?qū)吙气B類進(jìn)行有效的性別鑒定，但應(yīng)該注意存在雄性個體鑒定出現(xiàn)假雌性的情況，所以在對鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率要求較高或鑒定樣品中雄性比例較高時，推薦聯(lián)合其他鑒定方法共同對鶇科鳥類進(jìn)行性別鑒定。

一種鳥類性別鑒定方法是否有實際應(yīng)用價值主要取決于鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率與鑒定的成功率。鑒定的準(zhǔn)確率能表明鑒定方法是否有效可行，而鑒定成功率則表明鑒定方法能否普遍應(yīng)用[26]。在實際應(yīng)用中，鶇科鳥類形態(tài)學(xué)性別鑒定簡便，但影響形態(tài)學(xué)性別鑒定準(zhǔn)確率和成功率的因素很多，容易出現(xiàn)偏差。若對鑒定準(zhǔn)確率要求較高，推薦使用CHD基因?qū)吙气B類進(jìn)行性別鑒定。

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