張朝暉 金巧智 馬志超

[摘要] 目的 觀察miRNA-29c在喉癌組織和喉癌Hep-2細(xì)胞株中的表達(dá)情況，研究其與腫瘤臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后等臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并探討miRNA-29c對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、侵襲的影響。 方法 選取2006年1月～2016年12月在我院確診的86例喉癌患者的蠟塊標(biāo)本，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)喉癌組織和癌旁正常喉黏膜上皮組織中miRNA-29c的表達(dá)，并分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系;通過(guò)Q-RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后每組細(xì)胞中miRNA-29c的表達(dá);CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化情況;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)跨膜細(xì)胞數(shù)量的變化。 結(jié)果 miRNA-29c在喉癌組織中相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織（P<0.01），其表達(dá)量與不同臨床分型、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）;轉(zhuǎn)染miRNA-29c模擬物組細(xì)胞中的miRNA-29c表達(dá)水平顯著高于無(wú)關(guān)序列組和空白對(duì)照組（P<0.01），并可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖和侵襲力（P<0.01）。 結(jié)論 在喉癌中，miRNA-29c是一個(gè)抑制性miRNA，miRNA-29c低表達(dá)可能是影響喉癌預(yù)后的重要因素;過(guò)表達(dá)miRNA-29c可顯著降低喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖和侵襲能力，miRNA表達(dá)水平的下調(diào)可能參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] miRNA-29c;喉癌;預(yù)后;增殖;侵襲

[Abstract] Objective To observe the expression of miRNA-29c in the tissue of laryngeal carcinoma and laryngeal carcinoma Hep-2 cell line， to study its relationship with clinical pathological parameters such as clinical staging， lymphatic metastasis and prognosis， and to investigate the effect of miRNA-29c on proliferation and invasion of laryngeal carcinoma Hep-2 cells. Methods Paraffin-embedded specimens of a total of 86 patients with laryngeal cancer who were diagnosed in our hospital from January 2006 to December 2016 were selected. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to detect the expression of miRNA-29c in laryngeal carcinoma tissues and adjacent normal laryngeal mucosa epithelial tissues， and its relationship with clinical pathological characteristics was analyzed; the expression of miRNA-29c in each group of cells after transfection was detected by Q-RT-PCR; CCK-8 was used to detect changes in cell proliferation ability; Transwell assays were used to detect changes in the number of transmembrane cells. Results The relative expression level of miRNA-29c in the tissue of laryngeal carcinoma was significantly lower than that in adjacent cancer tissues （P<0.01）. The expression level was closely related to different clinical stages， TNM stages and lymphatic metastasis （P<0.05）; the expression level of miRNA-29c in the cells of transfected miRNA-29c mimic group was significantly higher than that in the unrelated sequence group and the blank control group（P<0.01）， and it can inhibit the proliferation and invasiveness of laryngeal carcinoma Hep-2 cells （P<0.01）. Conclusion In laryngeal cancer， miRNA-29c is an inhibitory miRNA. Low expression of miRNA-29c may be an important factor affecting the prognosis of laryngeal cancer; overexpression of miRNA-29c can significantly reduce the proliferation and invasiveness of laryngeal carcinoma Hep-2 cells. Down-regulation of miRNA expression level may be involved in the occurrence， development， invasion and metastasis of laryngeal carcinoma.

[Key words] miRNA-29c; Laryngeal carcinoma; Prognosis; Proliferation; Invasion

喉癌是頭頸部腫瘤中常見(jiàn)的惡性腫瘤，相當(dāng)一部分晚期喉癌的5年生存率僅有大概51%[1]。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是當(dāng)前研究熱點(diǎn)和前沿之一[2]。miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)和功能參與生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如凋亡、增殖及分化，發(fā)揮類(lèi)似癌基因或抑癌基因的作用[3-5]。最新研究顯示，miRNA-29c表達(dá)異常減少是導(dǎo)致一些惡性腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖及腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[6-8]。但暫時(shí)未見(jiàn)與喉癌的相關(guān)的報(bào)道。本研究檢測(cè)miRNA-29c在喉癌及癌旁組織中的表達(dá)，并探討其與臨床病理特征的關(guān)系及對(duì)腫瘤預(yù)后的影響。此外以喉癌細(xì)胞系Hep-2為研究對(duì)象，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)提高了Hep-2細(xì)胞中miRNA-29c的表達(dá)水平，觀察miRNA-29c對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

選取2006年1月～2016年12月在我院耳鼻喉科經(jīng)手術(shù)切除的喉癌患者的蠟塊標(biāo)本86例作為喉癌實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)，將42例石蠟包埋的癌旁正常喉黏膜上皮組織作為對(duì)照組。86例喉癌患者中，男79例，女7例，年齡47～82歲，平均（62.3±5.5）歲，所有患者在手術(shù)前均未接受放化療或其他治療。

1.2 細(xì)胞及試劑

人喉鱗Hep-2細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco公司），CCK-8試劑盒（Bryotime公司），核糖核酸試劑盒Trizol及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（Invitrogen公司）;Real MasterMix（SYBR Green）熒光定量PCR試劑盒（Tiangen公司）;Transwell小室（Corning公司）;Matrigel Basement Membrane Matrix（BD公司）;miRNA-29c模擬物（miRNA-29c mimics）及無(wú)關(guān)序列（negetive control，NC）由Ribobio合成。

1.3 方法

1.3.1 Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)? 將人喉癌Hep-2細(xì)胞接種于6孔板，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，條件是37℃、含5% CO2。實(shí)驗(yàn)分為三組： miNRA-29c mimics組（miRNA-29c模擬物+Lipo2000）;NC組（NC+ Lipo2000）;mock組（正常空白對(duì)照）。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率? 待Hep-2細(xì)胞株的生長(zhǎng)密度達(dá)到約80%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM 2000的操作說(shuō)明書(shū)，使用Lipo 2000分別將miRNA-29c模擬物和無(wú)關(guān)序列NC轉(zhuǎn)染至Hep-2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染Cy3-NC 24 h后，利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率并拍照。

1.3.3 Q-RT-PCR用于檢測(cè)喉癌標(biāo)本及癌旁組織中mRNA-29c的表達(dá)量? 將每個(gè)蠟塊樣品切成10 μm 厚的切片，并取5個(gè)切片提取總RNA。根據(jù)Trizol說(shuō)明書(shū)的方法，進(jìn)行細(xì)胞的總RNA的提取，并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)A260/A280。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并將合成的cDNA稀釋10倍。按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：預(yù)變性95℃ 30 s，變形95℃ 5 s，退火延伸60℃ 30 s， 擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。記錄每個(gè)孔的CT值，并取3個(gè)孔的平均值作為結(jié)果，以U6為內(nèi)參基因，并采用2-△△Ct法計(jì)算miRNA-29c的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.4 Q-RT-PCR檢測(cè)3組細(xì)胞中mRNA-29c的表達(dá)量? 將每組Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，按照Trizol說(shuō)明書(shū)方法提取細(xì)胞總RNA，具體實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.3。miRNA-29c和U6引物序列見(jiàn)表1。

1.3.5 CCK-8檢測(cè)Hep-2細(xì)胞增殖能力的變化? 在不同的96孔上接種細(xì)胞懸液，均設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，再進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h后于每孔中加入10 μL 的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光值（A值），檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，A值越高，表明活細(xì)胞數(shù)越多，細(xì)胞增殖活性也就越高。

1.3.6 Transwell法檢測(cè)Hep-2細(xì)胞侵襲能力的變化? Matrigel基質(zhì)膠利用無(wú)血清1640培養(yǎng)基稀釋?zhuān)瑵舛葹?0 mg/L，以 50 μL的體積加入Transwell小室的上室。37℃放置30 min。分別將3組細(xì)胞（2.0×105個(gè)/L）的懸液200 μL加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室的上室，置于37℃、5% CO2 孵箱培養(yǎng)24 h。0.1%結(jié)晶紫染色30 min，自來(lái)水洗凈后，用濕棉試子除去聚碳酸酯膜上表面的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下直接觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞。最后，在33%醋酸中洗滌細(xì)胞小室，利用紫外分光光度測(cè)量570 nm處的A值，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS19.0軟件，GraphPad Prims 8.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-29c在喉癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

Q-RT-PCR結(jié)果顯示，miRNA-29c在喉癌組織及癌旁正常喉黏膜上皮組織中的表達(dá)水平分別為（0.23±0.09）、（0.78±0.15），miRNA-29c在喉癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.96，P<0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1? ?miRNA-29c在喉癌和癌旁組織中的表達(dá)情況

2.2 miRNA-29c表達(dá)與喉癌臨床病理的關(guān)系

miRNA-29c的表達(dá)水平與患者臨床分期、T分期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05），而與患者的性別、年齡、吸煙、分型及分化程度無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2? ?miRNA-29c的表達(dá)與喉癌各臨床病理參數(shù)的關(guān)系（x±s）

2.3 檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

Hep-2細(xì)胞經(jīng)帶有Cy3熒光蛋白的無(wú)關(guān)序列（Cy3-NC）轉(zhuǎn)染24 h，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染效率約90%（封三圖1）。

2.4 Q-RT-PCR檢測(cè)miRNA-29c在Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)情況

Q-RP-PCR結(jié)果顯示，miRNA-29c mimics組、NC組和空白對(duì)照組中miRNA-29c的表達(dá)水平分別為（17.25±1.51）、（1.63±0.52）、（1.71±0.69）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics的Hep-2細(xì)胞與NC組及空白對(duì)照組相比，miRNA-29c的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics可以明顯上調(diào)Hep-2細(xì)胞的miRNA-29c表達(dá)水平。

2.5 轉(zhuǎn)染miRNA-29c對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響

CCK-8測(cè)定的結(jié)果顯示（封三圖2），miRNA-29c mimics組、NC組和空白對(duì)照組的A值分別為（0.61±0.20）、（0.87±0.21）、（0.86±0.24）。結(jié)果表明，NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞增殖能力明顯高于轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics后的Hep-2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），NC組和空白對(duì)照組相比細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異（P>0.05）。轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics能抑制Hep-2細(xì)胞的增殖活性（封三圖3）。

2.6 miRNA-29c mimics轉(zhuǎn)染對(duì)Hep-2細(xì)胞侵襲力的影響

Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miRNA-29c mimics組、NC組和空白對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（0.21±0.09）、（0.77±0.11）、（0.78±0.13）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics后，Hep-2細(xì)胞侵襲能力顯著低于NC組及空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），NC組和空白對(duì)照組間侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)封三圖4。

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞內(nèi)各種基因突變相關(guān)，并且與表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的紊亂密切相關(guān)。miRNA作為表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，它的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的診斷治療研究提供了新的方向， miRNA的表達(dá)具有明顯的組織特異性，其表達(dá)紊亂可能和許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。近年來(lái)，許多研究表明，miRNA的異常表達(dá)與喉癌的增殖、分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[9-12]。

深入研究miRNA與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，將為生物學(xué)治療喉癌提供有力的理論指導(dǎo)。既往研究表明，miRNA-23a[13]、miRNA-16[14]在喉癌組織中表達(dá)異常，這說(shuō)明miRNA與喉癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，深入研究miRNA在喉癌中的表達(dá)對(duì)其臨床診療具有重要意義。miRNA-29c是Yu等[15]最早在血液系統(tǒng)疾病中發(fā)現(xiàn)其與疾病相關(guān)，之后諸多文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA-29c參與如膀胱癌[16]、子宮內(nèi)膜癌[17]、黑色素瘤[18]等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。一項(xiàng)針對(duì)110例患者長(zhǎng)達(dá)平均72 個(gè)月的隨訪發(fā)現(xiàn)miRNA-29c可作為慢性淋巴細(xì)胞白血病的預(yù)后指標(biāo)，但尚未進(jìn)行功能研究[19]。Pass 等[20]也證明miRNA-29c可評(píng)估惡性胸膜間皮瘤獨(dú)立的預(yù)后情況，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)隨著miRNA-29c的表達(dá)增加、腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和克隆生長(zhǎng)降低。國(guó)內(nèi)代大偉等[21]通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-29c 提高膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞內(nèi)miRNA-29c表達(dá)量，并通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)miRNA-29c可抑制細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡比例明顯升高，同時(shí)侵襲能力明顯下降，提示miRNA-29c可能具有抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。miRNA-29c在腫瘤中發(fā)揮如此重要的作用，但是在喉癌中的功能卻未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)Q-RT-PCR檢測(cè)miRNA-29c在86例喉癌組織和42例癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)喉癌中miRNA-29c的表達(dá)水平明顯低于正常組織，研究還發(fā)現(xiàn)臨床分期越晚，分化程度越低或伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者喉癌組織中miRNA-29c的表達(dá)水平也相對(duì)較低，miRNA-29c的低表達(dá)對(duì)腫瘤預(yù)后有不利影響，它是喉癌患者預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素。為了進(jìn)一步探討將miRNA-29c用于喉癌生物靶向治療的可能性，以喉癌Hep-2為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics來(lái)進(jìn)行一系列的研究。通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Lipo2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率約為90%;Q-RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染模擬物后miRNA-29c的表達(dá)上調(diào)了10倍以上，表明轉(zhuǎn)染的效果顯著;CCK-8及Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-29c后Hep-2細(xì)胞的增殖、侵襲能力受到明顯抑制，較NC組及空白對(duì)照組有顯著差異（P<0.01）;這表明miRNA-29c可在體外顯著抑制Hep-2細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)及侵襲能力。

綜上所述，在喉癌中miRNA-29c是一個(gè)抑制性miRNA，過(guò)表達(dá)miRNA-29c可以顯著抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，如喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖及侵襲能力。miRNA-29c可能參與喉癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。其作用機(jī)制探討將成為本課題組下一步研究的方向，闡明這些機(jī)制也將更有助于miRNA-29c介導(dǎo)的生物靶向治療作為一種新型的診療技術(shù)應(yīng)用于喉癌的臨床治療及預(yù)后判斷。

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（收稿日期：2020-06-19）