劉丹蕾，張子蕾，吳清平，田 鵬，耿浩然，徐 婷，王大鵬,*

1. 引言

人源諾如病毒（human norovirus, HuNoV）是非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原，導(dǎo)致全世界50%不同年齡段人群發(fā)病[1,2]。諾如病毒（norovirus, NoV）是類屬于杯狀病毒科（Caliciviridae）的無(wú)包膜單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)度約為7.5 kb [3]?；蚪M編碼3個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame,orf1,orf2,orf3）。orf1編碼包括RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)蛋白，orf2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白（VP1），orf3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白（VP2）[4]。NoV分為10個(gè)基因族（GI-GX），包含40余種基因型，每個(gè)基因型又含有多種亞型[5]。VP1氨基酸序列差異小于14.1%的病毒株被認(rèn)為是同一基因亞型水平，存在14.3%～43.8%差異的被認(rèn)為屬于同一聚類水平（基因型），差異為44.9%～61.4%的屬于同一族水平[6]。GI和GII族HuNoV主要引起人類急性胃腸炎，其中，過(guò)去的幾十年中GII.4型HuNoV一直是流行毒株[7]。

由于缺乏簡(jiǎn)便可靠的體外培養(yǎng)體系，目前常用于檢測(cè)HuNoV的方法包括電子顯微鏡法（electron microscopy, EM）[8]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）[9]以及諸如RT-PCR和RT-qPCR的分子方法等[10–12]。其中，RT-qPCR方法由于無(wú)需使用瓊脂糖凝膠分析、可即時(shí)確認(rèn)、特異性和靈敏度高于RT-PCR等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，成為HuNoV檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。多年來(lái)，orf1-orf2連接處被認(rèn)為是HuNoV基因組中最保守的區(qū)域，并以此設(shè)計(jì)了引物探針用于RT-qPCR檢測(cè)[13–15]。2003年，Kageyama等[13]設(shè)計(jì)了第一套用于檢測(cè)GI和GII族NoV的引物和探針；2004—2007年，引物和探針又得到了更新[13,16–19]。目前，這些引物和探針仍然被廣泛用于HuNoV的檢測(cè)中，亦未進(jìn)行更新。NoV基因組由RNA編碼，易突變，從而導(dǎo)致設(shè)計(jì)的引物和（或）探針無(wú)法有效地與已進(jìn)化的新病毒核酸進(jìn)行匹配。數(shù)據(jù)庫(kù)中公布了諸多的新病毒株基因組信息，有必要利用更新的序列數(shù)據(jù)庫(kù)重新設(shè)計(jì)新的引物/探針組，從而優(yōu)化HuNoV分子檢測(cè)體系。

本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載了2010年1月到2018年5月的GI和GII族HuNoV基因組序列，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析后，在一組具有HuNoV典型基因型的基因組序列中，重新設(shè)計(jì)和評(píng)估GI和GII族HuNoV的引物/探針，建立相應(yīng)的RT-qPCR檢測(cè)體系，并與現(xiàn)有Kageyama所報(bào)道的檢測(cè)體系進(jìn)行了比較。

2. 材料與方法

2.1. 目標(biāo)序列的收集

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）?? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ? https://www.megasoftware.net/檢索自2010年1月到2018年5月來(lái)源于中國(guó)的GII族HuNoV完整基因組132條。鑒于國(guó)內(nèi)鮮有2010年1月之后完整GI族HuNoV基因組數(shù)據(jù)，因此本研究從NCBI下載了57條完整GI族HuNoV基因組序列，并根據(jù)2.2節(jié)中提到的方法進(jìn)行比對(duì)，以確定GI的保守區(qū)域。使用GI.2序列較為保守的片段（GenBank號(hào)：KF306212.1）5288～5427作為基本局部比對(duì)搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool,BLSAT）搜索的模板，以相似性高于80%為標(biāo)準(zhǔn)，從NCBI中檢索到了2010年1月后公布的90條GI族上述區(qū)域的核酸片段。

2.2. 序列的多重比對(duì)和引物探針的優(yōu)化設(shè)計(jì)

對(duì)2.1節(jié)下載的GI族（57條）和GII族（132條）NoV的全基因組序列分別以Simplot程序（3.5.1版）[20]分析各自的保守區(qū)域，用于后續(xù)設(shè)計(jì)新的引物和探針。本研究以GenBank號(hào)為KF306212.1 (GI.2)和KU870455.1 (GII.6)的全基因組序列為參考序列，利用MEGA 7.0軟件?? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ? https://www.megasoftware.net/分別對(duì)GI和GII族HuNoV基因組保守區(qū)序列構(gòu)建最大似然（maximum likelihood, ML）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用bootstrap測(cè)試（1000次計(jì)算）評(píng)估集群結(jié)果的可靠性。在分析GI和GII族HuNoV核苷酸（nt）保守區(qū)及保守趨勢(shì)分布后，結(jié)合引物和探針設(shè)計(jì)的基本規(guī)則，設(shè)計(jì)兩套引物/探針（表1），并命名為L(zhǎng)ZIF、LZIR-A、LZIR-B、LZIP（GI族）及LZIIF-A、LZIIF-B、LZIIR和LZIIP（GII族）。

2.3. 從臨床樣本中提取病毒RNA

HuNoV陽(yáng)性臨床樣本由北京市疾病預(yù)防控制中心高志勇博士、浙江省疾病預(yù)防控制中心廖寧波博士和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心李慧穎博士提供。以磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline, PBS, pH=7.2～7.4）按照10%（m/V）稀釋糞便樣品，以4378 r·min?1離心5 min，上清分裝后于?80 ℃保存。取140 μL處理樣本，按照HiPure病毒RNA抽提試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)提取核酸，最后使用60 μL不含RNase的ddH2O進(jìn)行RNA洗脫；立即使用或分裝后儲(chǔ)存于?80 ℃冰箱備用。

2.4. 制備RNA 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板

以GI.5型HuNoV（樣品57565）為模板，引物GI-4610-F (5'-TGATGCWGAYTATACAGCWTGGGA-3')和GI-5704R (5'-CATYTTYCCAACCCARCCATTATACAT-3')逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增目標(biāo)片段；以GII.17型HuNoV（樣品15651202）的RNA為模板，以引物P290 [21]和GIISKR[22]逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增目標(biāo)片段。GI族的目標(biāo)片段位置為4558～5675（以GenBank號(hào)KF306212.1基因組為計(jì)算依據(jù)），GII族的擴(kuò)增片段位置為4298～5383（GenBank號(hào)KU870455.1基因組為計(jì)算依據(jù)）。采用一步RT-PCR試劑盒（Takara，中國(guó)大連）說(shuō)明書(shū)的方案，在總體積為20.0 μL的條件下進(jìn)行RT-PCR。PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體（Takara，中國(guó)大連）中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10（GENEWIZ，中國(guó)蘇州）。測(cè)序驗(yàn)證后，以核酸內(nèi)切酶Hind III和BamH I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將目標(biāo)片段分別插入到含有T7啟動(dòng)子的pET-28a (+)質(zhì)粒（ThermoFisher，中國(guó)上海）中，獲得重組質(zhì)粒pET28-GI-M和pET28-GII-M并送往GENEWIZ（中國(guó)蘇州）測(cè)序。

表1 本研究中新的HuNoV檢測(cè)引物和探針相關(guān)信息

隨后參照T7 RNA聚合酶（Beyotime，中國(guó)上海）說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行重組質(zhì)粒中目標(biāo)DNA片段體外轉(zhuǎn)錄，獲得RNA模板。純化后的RNA分裝并于?80 ℃保存。

2.5. 一步法RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)

以一步法 PrimeScript? RT-PCR kit (Perfect Real Time)試劑盒（Takara，中國(guó)大連），在CFX96型熒光定量PCR儀（Biorad，美國(guó)）中進(jìn)行新型雙重RT-qPCR（ND-RT-qPCR）反應(yīng)。使用改良的熒光基團(tuán)和猝滅劑合成了重新設(shè)計(jì)的探針（GENEWIZ，中國(guó)蘇州）。每10.0 μL反應(yīng)體系中，包含5.0 μL 2×一步法RT-PCR緩沖液III、0.2 μLEx TaqHS（5 U·μL?1，1 U= 1 μmol·min–1）、0.2 μL PrimeScript RT酶 混 合 物II、1.2 μL不含RNase的水、1.0 μL混合引物（每條引物的終濃度為0.8 μmol·L?1）、0.2 μL GI族探針（10.0 μmol·L?1）、0.2 μL GII族探針（10.0 μmol·L?1）和2.0 μL 模板RNA。循環(huán)參數(shù)如下：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄3 min；95 ℃熱裂解5 s；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括95 ℃ 3 s，60 ℃ 7 s，在每個(gè)延伸步驟結(jié)束時(shí)讀取熒光值。閾值使用Bio-Rad CFX96管理軟件默認(rèn)參數(shù)確定。

2.6. 基于模板RNA 的RT-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用NanoDrop 2000C分光光度計(jì)（NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA）測(cè)量2.4節(jié)中制備的體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA模板的濃度，并轉(zhuǎn)換為基因組拷貝數(shù)。RNA拷貝總數(shù)計(jì)算如下：拷貝數(shù)=RNA濃度（ng·μL?1）/摩爾質(zhì)量×6.02×1023。RNA模板進(jìn)行10倍系列稀釋（100～106拷貝·μL?1）。繪制RNA拷貝數(shù)與熒光信號(hào)達(dá)到閾值所需循環(huán)數(shù)（定量循環(huán)，quantification cycle, Cq）的關(guān)系，獲得GI族和GII族NoV的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。重復(fù)此實(shí)驗(yàn)并計(jì)算平均Cq值，以確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和回歸值，R2系數(shù)通過(guò)Origin 2017軟件進(jìn)行擬合計(jì)算獲得。隨后，使用以下公式計(jì)算PCR反應(yīng)效率：效率E= 10–1/斜率–1 [23]。

2.7. 三種RT-qPCR 方法檢測(cè)HuNoV 的評(píng)價(jià)

以Kageyama等設(shè)計(jì)的HuNoV熒光定量檢測(cè)方法為對(duì)照，與本研究建立的ND-RT-qPCR（2.3節(jié)）進(jìn)行比較分析。

實(shí)驗(yàn)A中，按照2.5節(jié)中所述進(jìn)行ND-RT-qPCR。實(shí)驗(yàn)B中，除使用Kageyama等[13]設(shè)計(jì)的引物和探針外，其他條件與實(shí)驗(yàn)A相同。實(shí)驗(yàn)C中，使用Kageyama等的RT-qPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序按照參考文獻(xiàn)[24]進(jìn)行設(shè)置。RT-qPCR反應(yīng)混合物包括：5.0 μL 2×一步法RT-PCR Buffer III、0.2 μLEx TaqHS(5 U·μL?1)、0.2 μL PrimeScript RT酶混合物II、每條引物0.4 μL（COGIF和COGIR，或COGIIF和COGIIR，濃 度 為 10 μmol·L?1）、0.2 μL每 條 探 針[RING1(a)-TP、RING1(b)-TP或RING2-TP，濃度為10 μmol·L?1]、2.0 μL RNA樣本，以不含RNase 的ddH2O調(diào)整總體積為10.0 μL。熱循環(huán)參數(shù)為：42 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 1 min，40次循環(huán)，在每個(gè)56 ℃延伸步驟結(jié)束時(shí)讀取熒光值。

以Cq值為40作為陰性樣品的閾值。比較上述A、B和C三種不同RT-qPCR反應(yīng)體系獲得同一個(gè)樣本的Cq值。

3. 結(jié)果

3.1. 序列保守性分析

利用PlotSimilarity方法確定了HuNoV檢測(cè)的候選保守區(qū)。本研究共分析了57條GI族和132條GII族HuNoV基因組序列（涵蓋國(guó)內(nèi)HuNoV的流行基因亞型），分別獲得了保守區(qū)域。最高相似性的保守區(qū)域位于GI族和GII族HuNoV的orf1-orf2連接處，可用于后續(xù)引物和探針的設(shè)計(jì)（數(shù)據(jù)未展示）。

3.2. GI 和GII 族保守區(qū)的核苷酸序列

為了設(shè)計(jì)檢測(cè)HuNoV流行株的引物和探針，將每個(gè)族的基因組序列進(jìn)行多重比對(duì)，以確定基因族中的最佳保守片段。采用以KF306212.1中5288～5427的核苷酸位置為標(biāo)準(zhǔn)，分析GI族HuNoV的保守區(qū)域堿基分布；以KU870455.1中4959～5108核苷酸位置為標(biāo)準(zhǔn)，分析GII族HuNoV的保守區(qū)域堿基分布，統(tǒng)計(jì)90條GI族HuNoV序列和132條GII族HuNoV序列上述片段中每個(gè)堿基的出現(xiàn)頻率，每個(gè)位置的A、T、C、G計(jì)數(shù)如圖1和圖2所示。本研究設(shè)計(jì)的引物和探針（橙色）與Kageyama等[13]報(bào)道的引物和探針（灰色）進(jìn)行了比較。NoV基因組中原GI族引物/探針?biāo)谖恢煤蛪A基已經(jīng)發(fā)生變化，導(dǎo)致其擴(kuò)增效率始終不高。基于現(xiàn)有流行病毒株序列比對(duì)結(jié)果，結(jié)合Tm值、G+C含量（%）、擴(kuò)增效率和基因組間的交叉反應(yīng)等因素，我們?cè)O(shè)計(jì)了GI和GII族HuNoV新的檢測(cè)引物和探針（表1）。

3.3. HuNoV 的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

以HEX和FAM分 別 標(biāo) 記GI族（LZIP） 和GII族（LZIIP）探針，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種基因族HuNoV。用新制備的GI和GII族體外轉(zhuǎn)錄的RNA模板，計(jì)算拷貝數(shù)后等比例稀釋；經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)，分析數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算反應(yīng)相關(guān)參數(shù)，如圖3和圖4所示。在檢測(cè)GI和GII族的HuNoV的樣本時(shí)，雙重檢測(cè)不存在交叉信號(hào)。GI族的引物探針的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= ?3.569lgx+39.161，R2= 1.000，E= 90.6%，GII族FAM信號(hào)無(wú)響應(yīng)；GII族的引物探針的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= ?3.387lgx+38.068，R2= 1.000，E= 97.3%，GI族HEX信號(hào)無(wú)響應(yīng)。

圖1. GI族保守區(qū)域每個(gè)位置的核苷酸分布圖。

圖2. GII族保守區(qū)域每個(gè)位置的核苷酸分布圖。

圖3. GI族HuNoV檢測(cè)的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。RFU (relative fluorescence unit)：相對(duì)熒光單位。

3.4. 三種RT-qPCR 方法檢測(cè)HuNoV 臨床樣本的比較

本研究比較了檢測(cè)臨床腹瀉樣品中GI和GII族HuNoV的三種RT-qPCR體系（表2）。在23份HuNoV臨床標(biāo)本中，5例為GI族HuNoV，18例為GII族HuNoV。對(duì)于GI族HuNoV，A方法檢出率為100% (5/5)，B方法無(wú)檢出（0/5），C方法檢出率為40% (2/5)。臨床樣本GI.2、GI.4、GI.5使用Kageyama的RT-qPCR方法檢測(cè)呈假陰性結(jié)果。針對(duì)C方法檢測(cè)出的兩份GI陽(yáng)性樣品，A方法Cq值顯著低于C方法（p<0.05），平均ΔCq值為10.26 ± 0.24，表現(xiàn)出更高的靈敏度。對(duì)于GII族HuNoV，A方法檢出率為100% (18/18)，B方法檢出率為50% (9/18)，C方法檢出率為94% (17/18)。樣本17151101 (GII.2)在B、C方法中均未檢出，且A方法低于C方法的平均Cq值，ΔCq值為2.20 ± 0.51。在B方法檢出樣本中，A方法的Cq值低于B方法的，平均ΔCq值為6.26 ± 0.64。

圖4. GII族HuNoVs檢測(cè)的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 三種RT-qPCR方法檢測(cè)HuNoV臨床標(biāo)本的比較結(jié)果

本研究中，A方法可檢測(cè)所有的臨床樣本中HuNoV。其他兩種檢測(cè)體系未檢出GI.2、GI.4和GI.5型HuNoV。方法B可以檢測(cè)到很少的GII族HuNoV基因型，對(duì)所有GI族HuNoV均未檢出。所以，方法A可以檢測(cè)到HuNoV的基因型，其檢出概率（100.0%）高于方法B（39.1%）和方法C（82.6%）。

4. 討論

HuNoV是導(dǎo)致世界范圍所有年齡段的非細(xì)菌性腹瀉疾病主要病原之一。自2016年以來(lái)，只有個(gè)別基因型HuNoV可以在腸上皮干細(xì)胞內(nèi)成功復(fù)制。因此，暫無(wú)有效的HuNoV體外培養(yǎng)體系，極大地阻礙了該病毒的研究進(jìn)展。目前，HuNoV檢測(cè)主要依靠ELISA、RT-PCR和RT-qPCR [25]。研究發(fā)現(xiàn)：這些方法的靈敏度分別為ELISA 17%、RT-PCR 86%和RT-qPCR 100% [26]。由于分子方法的檢測(cè)靈敏度較高，常用于HuNoV的檢測(cè)。

一步法RT-qPCR可在單個(gè)PCR管內(nèi)進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的擴(kuò)增。另外，RT-qPCR比RT-PCR更為靈敏，并且避免了PCR產(chǎn)物電泳的步驟[25]。許多研究者已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)GI和GII族HuNoV的RT-qPCR體系，并進(jìn)行推廣使用[13,16–19]。然而，所使用的引物和探針均是基于10～15年前病毒序列設(shè)計(jì)的。此外，包括保守區(qū)域在內(nèi)的病毒RNA基因組容易發(fā)生突變，導(dǎo)致使用的引物/探針與目前的病毒基因組無(wú)法結(jié)合或結(jié)合不良的情況，從而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，或由于擴(kuò)增效率不佳，遠(yuǎn)低估了病毒滴度。最近，Amarasiri等重新設(shè)計(jì)了RT-qPCR的檢測(cè)引物和探針，用于定量分析4種流行病學(xué)上重要的基因型GII.3、GII.4、GII.6和GII.17型HuNoV[27]。但是，未提及GII族其他的基因型和整個(gè)GI族。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)RT-qPCR方法漏檢3份GI族HuNoV樣本（表2）。因此，重新設(shè)計(jì)GI族HuNoV特異性引物/探針顯得尤為重要。與臨床樣本中含有高滴度GII族HuNoV不同[28]，GI族HuNoV常見(jiàn)于食品和環(huán)境樣本[29,30]，需要高靈敏度的檢測(cè)以避免漏檢。

為了設(shè)計(jì)新的引物和探針，我們考慮了如下幾個(gè)因素：

（1）選定區(qū)域片段的保守性，用于設(shè)計(jì)引物和探針的序列應(yīng)盡可能保守，尤其是引物3′端的保守性影響后續(xù)的PCR延伸；

（2）引物和探針的Tm值，為了縮短檢測(cè)周期（將退火和延伸合為一步），根據(jù)酶最佳效率在60 ℃，將引物最佳Tm值調(diào)整為60～63 ℃，探針Tm值比引物高5～10 ℃；

（3）反向引物和探針之間的距離越短，反應(yīng)過(guò)程中的探針酶解效率越高；

（4）為了提高探針雜交的穩(wěn)定性，本研究選取了鳥(niǎo)嘌呤多于胞嘧啶的反向互補(bǔ)序列用于探針合成；

（5）為了避免GI和GII族病毒之間的交叉反應(yīng)，本研究重新設(shè)計(jì)了引物/探針集，以便在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)GI和GII不同族的HuNoV。

我們發(fā)現(xiàn)由于引物COG2F（由Kageyama的GII族HuNoV上游引物）可以結(jié)合GI族的模板并進(jìn)行擴(kuò)增（數(shù)據(jù)未顯示），因此，雖然該區(qū)域仍具有較好的保守性（圖3、圖4），本研究并未根據(jù)參考COG2F序列設(shè)計(jì)新的GII族上游引物。我們發(fā)現(xiàn)，GI族保守區(qū)域中可完美匹配的引物/探針序列較短，并且Tm值相對(duì)較低。為了實(shí)現(xiàn)ND-RT-qPCR在同一反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)GI和GII族HuNoV，我們采用TaqMan-MGB作為探針的猝滅基團(tuán)，3′端的MGB組分增加了探針的Tm值并可以提高探針的靈敏度和可靠性。5′熒光基團(tuán)和3′非光化學(xué)熒光猝滅基團(tuán)（non-photochemical fluorescence quenching,NFQ）組合時(shí)，NFQ具有較低背景信號(hào)的優(yōu)勢(shì)，從而可以提高定量的精度。

擴(kuò)增效率是評(píng)估引物/探針組的一個(gè)重要指標(biāo)。對(duì)于RT-qPCR反應(yīng)，擴(kuò)增效率在90%～110%為可接受范圍[31,32]。本研究中，針對(duì)GI和GII族HuNoV新引物/探針組的擴(kuò)增效率分別為90.6%和97.3%。GI族引物探針效率相對(duì)較低的原因可能有3個(gè)：①GI族完整的基因組數(shù)據(jù)較少，影響后續(xù)的引物探針設(shè)計(jì)；②HEX探針熒光基團(tuán)修飾困難，熒光檢測(cè)時(shí)發(fā)光的效率較低，后續(xù)合成建議換為VIC；③引物和探針的濃度需要進(jìn)一步優(yōu)化。目前的效率處于可接受范圍內(nèi)，可以使用。

前期研究表明，RT-qPCR接近檢測(cè)極限的響應(yīng)信號(hào)，很多是由于PCR制品和（或）PCR污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果，并非源自目標(biāo)片段的擴(kuò)增[33–35]。在某些情況下，RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟中引物退火溫度的降低可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，從而使探針的背景信號(hào)升高。為此，我們通過(guò)縮短熱循環(huán)過(guò)程中每個(gè)步驟的反應(yīng)時(shí)間，以期減少非特異性探針雜交的概率，并將整體檢測(cè)周期縮短至約40 min。MIQE指南（The MIQE guidelines:Minimum Information for Publication of Quantitative Real Time PCR Experiments）認(rèn)為Cq > 40是“陽(yáng)性但不可量化”[23]。因此，本研究將40個(gè)循環(huán)設(shè)為臨界值。

本研究以自主設(shè)計(jì)的HuNoV RNA模板進(jìn)行ND-RT-qPCR體系的靈敏度評(píng)估。與以前報(bào)道的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制不同[17,36,37]，本研究以兩條大于1500 nt體外轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板，代替先前的質(zhì)粒模板。與短的DNA和質(zhì)粒相比，體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的長(zhǎng)片段RNA可以更好地還原病毒RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)；同時(shí)，生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線還可以進(jìn)一步反映一步法RT-qPCR檢測(cè)方法逆轉(zhuǎn)錄部分中病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄的效率。使用長(zhǎng)片段病毒RNA作為模板，從100到106拷貝生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=1.00；當(dāng) 測(cè) 試100拷 貝GI和GII族 時(shí)，Cq值 分 別 為39.10和37.90，進(jìn)一步稀釋病毒RNA模板后未檢測(cè)到信號(hào)（圖3、圖4）。結(jié)果表明，ND-RT-qPCR的靈敏度為100拷貝，比Kageyama等RT-qPCR的靈敏度高10倍。

以HuNoV臨床樣本對(duì)引物探針進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)ND-RT-qPCR相較傳統(tǒng)方法展現(xiàn)出更好的性能。ND-RT-qPCR對(duì)GI和GII族HuNoV的檢出率為100.0%。但是，Kageyama的RT-qPCR方法只在5個(gè)GI族HuNoV樣本中檢測(cè)到兩個(gè)樣本；意味著傳統(tǒng)的引物/探針組已經(jīng)不適用于檢測(cè)目前的GI族病毒樣本，且檢測(cè)靈敏也較低。在之前的文獻(xiàn)中也有類似的報(bào)道[18,38,39]。與傳統(tǒng)的RT-qPCR方法相比，在每個(gè)測(cè)試樣品中，較低Cq值反映出ND-RT-qPCR方法的靈敏度和擴(kuò)增效率較高。

本研究參照一步法RT-qPCR試劑盒的建議，將引物的Tm值設(shè)為60～63 ℃；正如一步法RT-qPCR試劑盒的建議，在60 ℃溫度下完成退火和延伸步驟，避免耗時(shí)的反復(fù)升降溫過(guò)程。因此，ND-RT-qPCR可以在40 min內(nèi)完成。為了評(píng)估Kageyama的引物/探針組能否適應(yīng)快速熱循環(huán)反應(yīng)，我們進(jìn)行了方法B的試驗(yàn)。結(jié)果表明，GI族HuNoV樣品檢出率為0 (0/5)，GII族HuNoV樣本漏檢率為50% (9/18)；顯示出Kageyama的引物/探針不適合縮短檢測(cè)時(shí)間。

綜上所述，本研究建立的ND-RT-qPCR體系可用于臨床樣本中HuNoV的高效檢測(cè)，并可以進(jìn)一步用于環(huán)境和食品樣品（尤其是新鮮產(chǎn)品或貝類中）中HuNoV的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本研究所設(shè)計(jì)的ND-RT-qPCR體系具有特異性高、靈敏度高且耗時(shí)短（40 min）等特點(diǎn)，可以適用于目前的GI和GII族HuNoV的快速檢測(cè)。

致謝

本工作得到了中國(guó)科學(xué)技術(shù)部（2017YFC1601200）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31772078）和上海交通大學(xué)Agri-X交叉學(xué)科基金（2017）的共同支持。

Compliance with ethics guidelines

Danlei Liu, Zilei Zhang, Qingping Wu, Peng Tian,Haoran Geng, Ting Xu, and Dapeng Wang declare that they have no conflicts of interest or financial conflicts to disclose.