盧國強 許 展 王 云 吉振勇*

（1.鎮(zhèn)江市鎮(zhèn)研種業(yè)有限公司， 江蘇鎮(zhèn)江 212005； 2.江蘇大學食品與生物工程學院， 江蘇鎮(zhèn)江 212013）

1 前言

辣椒 (Capsicum annuumL.) 是我國重要的蔬菜作物，栽培區(qū)域廣泛、適應性強，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛。利用雜種優(yōu)勢選育抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質的雜交種，是辣椒品種選育過程中最常用的方法。但雜交育種的過程中，由于人工去雄不徹底或育性不徹底等原因導致母本自交產(chǎn)生假雜種；此外，在制種過程中由于隔離不嚴而導致其他混雜花粉摻入等影響雜交種純度。傳統(tǒng)的種子鑒定方法主要有種子形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法和田間小區(qū)種植鑒定法，這些方法不僅需要較多的土地、勞力與財力等限制因素，而且鑒定周期長，且易受經(jīng)驗限制及栽培措施和環(huán)境因素的影響，其準確性難以保證[1]。

隨著DNA 分子標記技術的問世及迅速發(fā)展，使得從基因組水平上檢測雜交種純度成為可能。與傳統(tǒng)的遺傳標記相比，分子標記具有操作簡單方便、多態(tài)性豐富、分析不受環(huán)境及基因是否表達影響和結果準確可靠等優(yōu)點[2]。相關序列擴增多態(tài)性 （Sequence-related amplified polymorphism, SRAP）是由美國加州大學Li 和Quiros 于2001 年在研究蕓薹屬作物時開發(fā)出來的一種基于PCR 的分子標記技術[3]，其原理是利用基因外顯子里G、C 含量豐富，而啟動子和內含子里A、T 含量豐富的特點設計兩套引物，對開放閱讀框 （Open reading frames, ORFs） 進行擴增，因不同個體的內含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP 標記具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、在基因組中分布均勻的特 點[4-5]，因而在作物遺傳連鎖圖譜構建[6]、重要性狀基因標記定位與克隆[7-8]、種質資源遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育分析[9-10]及遺傳純度檢測[11-12]等方面有著廣泛應用?！?zhèn)研958 六號’辣椒品種早熟、高產(chǎn)且表現(xiàn)出較好的抗病性，具有很高的推廣應用前景。試驗以‘鎮(zhèn)研958 六號’F1代種及其親本為材料，采用SRAP 標記技術對雜交一代種子進行檢測，旨在為‘鎮(zhèn)研958 六號’F1代純度鑒定提供依據(jù)，進而為辣椒雜交種品種真實性分子標記鑒定和雜交種子純度分子標記檢測技術提供理論基礎, 為新品種審定和推廣提供技術支撐。

2 材料與方法

2.1 材料

‘鎮(zhèn)研958 六號’及其父母本來自鎮(zhèn)研種業(yè)有限公司的江蘇徐州原種擴繁基地，于2020 年5 月品種正常成熟時取其植株葉片，提取DNA。

2.2 DNA 的提取

DNA 的提取采用CTAB 法[13]。辣椒葉片于液氮中研磨成粉后轉移至50 mL 離心管中，加入DNA 提取緩沖液 （1% CTAB、0.7 M NaCl、10 mM EDTA、20 mM β-巰基乙醇），將離心管置于65 ℃振蕩水浴90 min，冷卻后加入等體積氯仿/異戊醇（24 ∶1） 溶液，混勻，8 000 r/min 離心10 min。將上清液轉移至另一滅菌離心管中，加入等體積異丙醇， 混勻，8 000 r/min 離心10 min，去上清， 沉淀用70%乙醇洗滌2 次，雙蒸水溶解。DNA 經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測、紫外分光光度計測定濃度和純度后，于4 ℃下保存?zhèn)溆没蛴?20 ℃下長期保存。

2.3 SRAP 擴增與檢測

引物設計參照Li 等[3]發(fā)表的引物序列，選用上游引物5 條、下游引物6 條，配對組合共30 對引物進行篩選（表1）。PCR 采用20 μL 體系，包含40 ～ 50 ng 模板DNA，3.0 mmol/L MgCl22 μL，1 mmol/L dNTPs 4 μL，1 μmol/L 引物 5 μL，1 U /μL Taq 酶 1 μL，用滅菌蒸餾水補齊至20 μL。SRAP 擴增程序為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1.5 min，5 個循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，33 個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。不同引物對PCR 反應退火溫度見表2。PCR 產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色。

表1 SRAP 引物與序列

表2 不同引物PCR 反應中所用退火溫度

3 結果與分析

3.1 辣椒葉片基因組DNA 的提取與檢測

Nanodrop 超微量分光光度計分析表明，提取辣椒葉片基因組DNA 的A260nm/A280nm的比值在1.8 ～2.0 之間，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示無明顯DNA 降解（圖1）。上述分析結果表明提取的DNA 質量良好，滿足分子標記檢測的要求。

3.2 特征引物篩選

本研究利用30 對SRAP 引物分別對受試辣椒品種進行多態(tài)性篩選，其中E3M1 引物在‘鎮(zhèn)研958 六號’雜種一代及其父母本中能擴增出穩(wěn)定、清晰的多態(tài)性條帶，擴增結果見圖2。E3M1 引物擴增片段的多態(tài)性屬于雙親互補型，用此方法檢測F1代，不但可以鑒定出F1代種子中母本的占有率，而且可以檢測出F1代種子中可能存在的摻假狀 況[14]。因此，本研究選取E3M1 引物用于‘鎮(zhèn)研958 六號’的種子純度鑒定。

3.3 雜種純度的鑒定

隨機選取49 株‘ 鎮(zhèn)研958 六號’辣椒植株的葉片樣品，提取DNA，以E3M1 為引物，分別進行SRAP 擴增，結果發(fā)現(xiàn)，第44 株出現(xiàn)母本特征譜帶，其余48 株出現(xiàn)F1代特征譜帶，純度為98%，假雜種為母本自交種子，與成株期形態(tài)鑒定結果相吻合。進一步的田間植株表型鑒定，在隨機選取的120 株‘鎮(zhèn)研958 六號’群體中，觀察到4 株表型表現(xiàn)與親本一致，田間種子純度鑒定為96.7%，與分子標記鑒定結果基本一致。

4 討論

目前辣椒雜交種純度主要的鑒定方法有田間形態(tài)學鑒定法和生化檢測法等。形態(tài)學鑒定法易受環(huán)境條件的限制，費時費力，鑒定的準確性也受觀察者經(jīng)驗的制約；生化檢測技術操作過程復雜，費事費錢，都不能滿足種子純度鑒定和育種工作發(fā)展的需要。SRAP 分子標記是直接以基因組DNA 為模板擴增的產(chǎn)物，具有準確、快速、不受基因表達和環(huán)境因素影響，且不受器官、組織及發(fā)育特異性等限制等優(yōu)點。此外，由于上游引物與下游引物可自由組配，因此用少數(shù)的引物可進行多種組合，大大減少了合成引物的費用，同時也提高了引物的利用率。

本研究利用SRAP 標記篩選出能在‘鎮(zhèn)研958 六號’F1代及其父母本間擴增出穩(wěn)定多態(tài)性的E3M1 引物，SRAP 分子標記種子純度鑒定結果與大田形態(tài)鑒定結果基本一致，這表明利用SRAP 標記建立的快速種子純度檢測體系鑒定辣椒種子純度是可行的，從而有望克服田間調查周期長、受環(huán)境因素干擾較大等問題。