張爽爽 張 悅 王健鸝 聶楚楚 滕 巍 王學(xué)國 王秀峰

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院， 長春 130033）

辣椒是重要的茄果類蔬菜，世界各地均有栽培。近年來我國辣椒播種面積不斷增加，已達(dá)到全國蔬菜總播種面積的8%～10%，居于蔬菜播種面積首位[1]。優(yōu)質(zhì)的種子是保證辣椒穩(wěn)定生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，目前市場上的辣椒品種多為雜交種，雜交種在制種過程中難免存在混雜的現(xiàn)象[2]，因此快速鑒定辣椒種子純度的工作已成為控制辣椒種子質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的純度鑒定采用田間形態(tài)觀察或同工酶的方法[3-4]，存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問題。近年來隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)鑒定種子純度的方法因具有快速、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已廣泛的應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中[5-6]，為檢測種子純度提供便利。

‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’辣椒是吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院茄果研究所自主選育品種，自2015 年以來在吉林省松原市、農(nóng)安縣 、洮南市、延邊州等地累計(jì)推廣1 040 hm2（1.56 萬畝），已成為吉林省辣椒生產(chǎn)的主要品種。為了避免‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’辣椒在實(shí)際推廣工作中出現(xiàn)雜種或者是假冒種子，本文以辣椒雜交種‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’及其親本為研究材料，從72 對候選引物中篩選出在雜交種及親本之間具有多態(tài)性且擴(kuò)增帶型穩(wěn)定的SSR 引物，以期建立快速、準(zhǔn)確的 ‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’辣椒種子純度鑒定體系，為品種的推廣工作提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

以‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’及其親本為試驗(yàn)材料，由吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院茄果研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 辣椒基因組DNA 的提取 田間取辣椒幼嫩葉片，采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取辣椒基因組DNA，并對提取DNA 的濃度及質(zhì)量進(jìn)行 檢測。

1.2.2 PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件 PCR 反應(yīng)體系：2×mix Buffer （含DNA 聚合酶、dNTP 等）7.5 μL，上游引物 +下游引物1 μL，DNA 模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O 至15 μL。

PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，52 ～55 ℃退火30 s（不同引物退火溫度有差異，根據(jù)引物實(shí)際參數(shù)設(shè)置溫度），72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物檢測 利用3%瓊脂糖凝膠電泳（160V, 30 min）進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 的提取與檢測

利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取 ‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’及其親本的基因組DNA，并對獲得的DNA 濃度及質(zhì)量進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示，DNA 濃度在25.8 ～31.6 ng/μL 之間，OD260/280數(shù)值在1.86 ～1.96 之間，符合后續(xù)PCR 試驗(yàn)要求。

表1 DNA 濃度及OD260/280

2.2 引物篩選

利用72 對引物分別對‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’及其親本DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，大多數(shù)引物都能擴(kuò)增出清晰的條代，只有SSR25、SSR41、SSR67 沒有擴(kuò)增出 條帶。其中SSR11、SSR14、SSR16、SSR34、SSR48 及SSR52（引物序列如表2 所示）在‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’及其親本間表現(xiàn)出多態(tài)性。

2.3 共顯性標(biāo)記確定

本試驗(yàn)篩選出6 對具有多態(tài)性的引物均為共顯性標(biāo)記，引物電泳圖如圖1 ～3 所示。 SSR11、SSR16、SSR 52 在‘吉椒15 號(hào)’及其親本、‘吉椒16 號(hào)’及其親本上均表現(xiàn)出多態(tài)性，這3 對引物可以有效地區(qū)分混雜在‘吉椒15 號(hào)’、‘吉椒16號(hào)’中的親本，而在實(shí)際生產(chǎn)上主要是母本混雜；SSR 14 在‘吉椒16 號(hào)’及其親本上表現(xiàn)出多態(tài)性，在‘吉椒15 號(hào)’及其親本之間并未表現(xiàn)出差異，該標(biāo)記只能區(qū)分‘吉椒16 號(hào)’及其親本；SSR 34和SSR 48 在‘吉椒15 號(hào)’ 及其親本上表現(xiàn)出多態(tài)性，在‘吉椒16 號(hào)’及其親本之間并未表現(xiàn)出差異，該標(biāo)記只能區(qū)分‘吉椒15 號(hào)’及其親本，引物多態(tài)性如表3 所示。

3 結(jié)論與討論

辣椒是雜種優(yōu)勢非常明顯的作物[7]，目前市場上的辣椒品種多為雜交種，雜交種在制種過程中多采用人工去雄的方式，難免存在去雄不徹底而造成母本混雜的現(xiàn)象。為了避免雜交種子中出現(xiàn)雜種或是假種的問題，進(jìn)行辣椒種子純度鑒定的工作是非常有必要的。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，利用SSR 分子標(biāo)記鑒定種子純度的方法已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在黃瓜、蘿卜等蔬菜作物[8-10]及玉米、水稻等大田作物[11-12]中，該技術(shù)原理明確、操作步驟成熟，為種子純度鑒定工作提供了便利。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SSR 分子標(biāo)記在檢測種子純度時(shí)，雜交種與親本之間的帶型表現(xiàn)為互補(bǔ)型時(shí)是進(jìn)行雜交種子純度鑒別的理想帶型[13]，也就是說共顯性標(biāo)記是鑒別種子純度的理想標(biāo)記。本文從72 對SSR 候選引物中篩選出在‘吉椒15 號(hào)’、‘吉椒16號(hào)’及其親本間表現(xiàn)出互補(bǔ)帶型的共顯性標(biāo)記6 對。本研究采用單個(gè)標(biāo)記能夠在基因組水平快速、有效地鑒定出‘吉椒15 號(hào)’、‘吉椒16 號(hào)’種子中混雜的母本，這與前人鑒定辣椒、黃瓜、玉米[2,5,8,11]等種子純度鑒定工作取得效果是一致的。另本研究發(fā)現(xiàn)采用多對引物組合的方式可有效區(qū)分是否存在異型株，例如利用SSR14 及SSR48 可區(qū)分‘吉椒15 號(hào)’及‘吉椒16 號(hào)’中是否存在相互混雜的問題。根據(jù)國家農(nóng)作物種子純度檢驗(yàn)要求，檢測樣本量要大于或等于100個(gè)[14]，基于備檢樣本數(shù)量多的要求，在實(shí)際檢測工作中可根據(jù)不同需要以及檢測成本等因素來選擇單個(gè)標(biāo)記的方式或是2 ～3 個(gè)標(biāo)記組合的方式來對混雜的親本或是異形株進(jìn)行鑒定。

表2 引物序列

表3 引物多態(tài)性

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)鑒定種子純度的方法已廣泛的應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中，為檢測種子純度提供便利。通過本研究篩選出的6 對共顯性標(biāo)記能夠在基因組水平快速地鑒定出‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’辣椒種子中混雜的母本或是異形株，明顯提高了辣椒種子純度檢測的效率，為‘吉椒15 號(hào)’和‘吉椒16 號(hào)’辣椒的推廣工作提供保障，同時(shí)為更多辣椒雜交種子純度檢測體系的建立提供了參考。