薛正楷，鄭文武，張宿義

（1.瀘州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 白酒學(xué)院，四川 瀘州646001；2.瀘州市生物醫(yī)學(xué)工程研究所，四川 瀘州646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 瀘州646001；4.瀘州老窖股份有限責(zé)任公司，四川 瀘州646002）

己酸是濃香型、醬香型等多種中國(guó)白酒的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，在白酒中起著呈香、助香、延長(zhǎng)酒體醇甜感及緩沖平衡作用[1-2]。其與酒曲發(fā)酵產(chǎn)生的酒精發(fā)生酯化反應(yīng)，生成濃香型白酒的所特有的主體香風(fēng)味成分-己酸乙酯，在濃香型白酒生產(chǎn)中，其優(yōu)級(jí)原酒中己酸乙酯要到達(dá)濃香型白酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一般需要10～50年以上窖池，其窖泥中馴化成熟的己酸菌豐度和產(chǎn)酸能力才能滿足生產(chǎn)需要[3-5]，因此選育高產(chǎn)己酸菌株，用于制備窖泥或灌窖等生產(chǎn)應(yīng)用，成為濃香型白酒企業(yè)提高濃香型白酒典型風(fēng)味特征及質(zhì)量的重要保障[6-9]。

微生物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SigA和SigB基因表達(dá)產(chǎn)物分別為σ70和σB，均屬于轉(zhuǎn)錄啟始因子家族，其中σ70為管家調(diào)節(jié)因子，調(diào)控大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄合成[10-13]；σB為應(yīng)激轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子，啟動(dòng)參與熱、酸、乙醇、鹽和氧化應(yīng)激性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[14-15]。

細(xì)菌同源重組定義是指發(fā)生在姐妹染色單體之間或同一染色體上含有同源序列的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子之間或分子之內(nèi)的重新組合，由此發(fā)展起來(lái)的同源重組技術(shù)是將待插入位點(diǎn)基因兩側(cè)的同源序列克隆質(zhì)粒中，并將目的基因插入兩段同源臂之間，質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合至細(xì)菌基因組從而獲得穩(wěn)定表達(dá)重組菌株的技術(shù)[16-20]。

本研究擬采用同源重組技術(shù)，同時(shí)將SigA和SigB基因轉(zhuǎn)入L.fusiformis菌株基因組的α-淀粉酶和蔗糖磷酸化酶基因位點(diǎn)，通過(guò)在濃香型白酒發(fā)酵模擬環(huán)境篩選，選育具有高抗逆性穩(wěn)定性狀的高產(chǎn)己酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 引物采用美國(guó)國(guó)家生物信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）提供的在線引物設(shè)計(jì)工具（http：//primer3.ut.ee/）分別對(duì)表達(dá)盒3和表達(dá)盒4設(shè)計(jì)引物，結(jié)果見表1。將表1設(shè)計(jì)的引物送上海生工生物工程有限公司合成。

表1 紡錘形賴氨酸芽孢桿菌表達(dá)盒及整合質(zhì)粒引物Table 1 Expression box and designed primers of integrated plasmids of Lysinibacillus fusiformis

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）：本研究所分離并保存；感受態(tài)大腸桿菌BL21：由西南醫(yī)科大學(xué)萬(wàn)海粟博士惠贈(zèng)；pBE2R：武漢淼靈生物科技有限公司。

1.1.3 試劑

酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、無(wú)水乙醇、醋酸鈉、氯化鈉：成都科龍?jiān)噭S；T4DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、HindIII、AatIII、NheI、AflIII、BamHI：美國(guó)ThermosFisher Scientific公司；DNA Ligation Kit Ver.2.1、Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0：大連TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）、DNA純化試劑盒、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、DNA Marker：天根生化有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：由上海生工生物工程有限公司合成；卡那霉素（分析純）：湖北信康醫(yī)藥化工有限公司；氨芐青霉素（分析純）：杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基與溶液

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH 7.0±0.2，固體培養(yǎng)基加入15 g瓊脂，121 ℃滅菌30 min。

改良麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，KCl 1.8 g，酵母膏4 g，醋酸鈉15 g，固體培養(yǎng)基加入瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min，使用前加入20 mL無(wú)水乙醇。

乙酸鈉培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g，KCl 1.8 g，酵母膏2.5 g，醋酸鈉8.2 g，固體培養(yǎng)基加入瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃滅菌30 min，使用前加入10 mL無(wú)水乙醇。

B2培養(yǎng)基：水解酪蛋白10 g，酵母粉25 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，K2HPO41 g，加900 mL去離子水，調(diào)pH值為7.5，定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

4×PAB培養(yǎng)基[21]：牛肉膏6 g，酵母膏6 g，蛋白胨20 g，葡萄糖4 g，NaCl 14 g，K2HPO414.72 g，KH2PO45.28 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

2×SMM溶液：4.6 g/L馬來(lái)酸，8.1 g/L MgCl2·6H2O，1 mol/L蔗糖。用NaOH調(diào)pH至6.5，121 ℃滅菌30 min。而后加入2 mol/L蔗糖至終濃度為1 mol/L。

菌體保護(hù)液SMPP：20 g/L 牛血清蛋白，0.1 mol/L蔗糖，1×PAB培養(yǎng)基，1×SMM溶液。其中，牛血清蛋白、蔗糖需單獨(dú)滅菌后再加入。

1.2 儀器與設(shè)備

BSD-YF3600全溫培養(yǎng)搖床：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：金壇市良友儀器有限公司；WD-9413A型凝膠成像分析系統(tǒng)、DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；Smart Spec Plus核酸蛋白分析儀：美國(guó)伯樂公司；GT9611梯度PCR儀：杭州艾普儀器設(shè)備股份有限公司；GC-2014島津氣相色譜儀：日本島津公司；YQX-T型厭氧培養(yǎng)箱：蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司；Scientz-2C基因?qū)雰x：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 同源定點(diǎn)整合載體構(gòu)建

（1）同源定點(diǎn)整合載體的設(shè)計(jì)

以產(chǎn)己酸菌L.fusiformis菌株α-淀粉酶（alpha-amlyase，NZ_CP010820）和蔗糖磷酸化酶基因（sugar phosphate iso merase，NZ_CP010820）上下游同源序列250 bp，分別為5'端和3'端，在其間依次插入多酶切位點(diǎn)（MCS，TTGCCTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAG）及終止序列（Terminator，TGATTAATTAATTCAGAACGCTCGGTTTCGGCCGGGCGTTTTTTTTGCA），結(jié)果如圖1所示。

圖1 紡錘形賴氨酸芽孢桿菌α-淀粉酶和蔗糖磷酸化酶基因同源整合載體設(shè)計(jì)Fig. 1 Design of homologous integration vectors for α-amylase and sucrose phosphatase genes from Lysinibacillus fusiformis

（2）同源定點(diǎn)整合載體pBE2R-AmyE-MCS和pBE2Rsugar phosphate isomer-MCS的篩選

分別按照?qǐng)D1設(shè)計(jì)各合成L.fusiformis菌株基因組的α-淀粉酶和蔗糖磷酸化酶基因上下游同源序列250 bp、MCS、終止子及酶切位點(diǎn)序列，送至上海生工生物工程有限公司合成，將合成序列經(jīng)AflII和AatII雙酶切后，經(jīng)DNA Ligation KitVer.2.1中的連接酶連接至同樣雙酶切的pBE2R片段上，獲得同源整合質(zhì)粒pBE2R-AmyE-MCS和pBE2Rsugar phosphate isomer-MCS，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，將轉(zhuǎn)化后菌液涂布于含100 μg/mL氨芐的LB的固體培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

分別各隨機(jī)挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化菌單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑陽(yáng)性克隆培養(yǎng)5 mL，取1 mL采用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行flII和AatII雙酶切鑒定，取酶切鑒定正確菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2SigA/SigB基因同源定點(diǎn)整合載體的構(gòu)建

（1）表達(dá)盒的設(shè)計(jì)

SigA表達(dá)盒的設(shè)計(jì)：上游酶切位點(diǎn)（HindIII）+雜交啟動(dòng)子+GGA+SD（GAGAGG）+AAAC+SigA+終止子+下游酶切位點(diǎn)（BamHI），雜交啟動(dòng)子參考YANG M等系列設(shè)計(jì)[12]。

SigB表達(dá)盒的設(shè)計(jì)：上游酶切位點(diǎn)（HindIII）+雜交啟動(dòng)子+GGA+SD（GAGAGG）+AAAC+SigB+終止子+下游酶切位點(diǎn)（BamHI）。

（2）pBE2R-AmyE-MCS-SigA和pBE2R-sugar isomer-MCS-SigB質(zhì)粒構(gòu)建

將1.3.2 項(xiàng)下設(shè)計(jì)的表達(dá)盒序列送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。將上述合成序列用HindIII和BamIII進(jìn)行雙酶切，經(jīng)DNA Ligation Kit Ver.2.1中的連接酶連接至同樣雙酶切的pBE2R-L.F-AmyE-MCS和pBE2R-L.F-sugar isomer-MCS片段上，獲得同源整合載體pBE2R-AmyE-MCSSigA和pBE2R-sugar isomer-MCS-SigB，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，將轉(zhuǎn)化后菌液涂布于含100 μg/mL氨芐的LB的固體培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

分別各隨機(jī)挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化菌單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑陽(yáng)性克隆培養(yǎng)5 mL，取1 mL采用天根質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行HindIII和BamIII進(jìn)行雙酶切鑒定，取酶切鑒定正確菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3L.fusiformis SigA和SigB同源單整合菌株的建立

L.fusiformis感受態(tài)菌株的建立、pBE2R-AmyE-MCSSigA和pBE2R-sugar isomer-MCS-SigB對(duì)L. fusiformis的電轉(zhuǎn)化參考薛正楷等的方法進(jìn)行[11]；采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取整合菌株總基因組DNA，采用表1引物進(jìn)行PCR鑒定。

（1）整合型L.fusiformis-SigA菌株的建立

冰上融化L. fusiformis感受態(tài)細(xì)胞，然后再加入1 μg pBE2R-sugar isomer-MCS-SigA至50 μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴5 min，將混合液加入預(yù)冷的2 mm電擊杯中，冰浴2 min后以電壓2 000 V，電容25 μF，電阻200 Ω，時(shí)間2.8 ms進(jìn)行電擊，電擊完畢取出杯子并立即加入500 μL SMMP溶液，洗脫感受態(tài)細(xì)胞，洗脫液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，37 ℃、250 r/min，復(fù)蘇1h。取200μL轉(zhuǎn)化液涂至含卡那霉素含量50μg/mL，乙醇含量4%的乙酸鈉培養(yǎng)基平板（pH 4），36 ℃培養(yǎng)38 h。

隨機(jī)挑取乙酸鈉平板單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑取PCR鑒定正確的克隆至5 mL，乙醇含量6%的改良麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（pH 4）中，取15 d發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min離心10 min，取490 μL上清加入10 μL內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（2-乙基丁酸），振蕩混勻，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，檢測(cè)條件參考薛正楷等[7]的方法進(jìn)行；選取產(chǎn)己酸最高菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

（2）整合型L.fusiformis-SigB菌株的建立

參考薛正楷等[11]的方法進(jìn)行構(gòu)建L.fusiformis-SigB菌株。

1.3.4 雙整合型L.fusiformis-SigA-SigB菌株的建立與篩選

取己酸產(chǎn)量最高的L. fusiformis-SigA和L. fusiformis-SigB制備感受態(tài)細(xì)胞；按1.3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)化和L.fusiformis-SigA-SigB菌株的篩選，選取產(chǎn)己酸最高菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.5 雙整合型L.fusiformis-SigA-SigB菌株關(guān)鍵性狀穩(wěn)定驗(yàn)證

取3只改良乙酸鈉培養(yǎng)基平板（pH=4，乙醇含量6%），挑1.3.4項(xiàng)下篩選成功菌株進(jìn)行劃線后，置于0.08 MPa、34 ℃真空培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落后，挑取長(zhǎng)出的菌落連續(xù)劃線培養(yǎng)32代后，觀察比較第32代與第1代菌落形態(tài)差異。

取6支試管，在傳代32代和第1代菌落的改良乙酸鈉培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取3個(gè)單克隆，接種至5 mL含50 μg/mL改良乙酸鈉（pH=4，乙醇含量6%）培養(yǎng)液中，90 ℃水浴5 min，置于0.07 MPa、36 ℃真空培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)15 d，進(jìn)行氣相色譜分析[4]。

挑取穩(wěn)定性鑒定合乎要求的菌落至5 mL麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基中，置于0.07 MPa、36 ℃真空培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6 d，取3 mL菌液送至上海生工生物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理與分析采用Excel 2019、SPSS 22.0軟件包和Sigma plot進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 pBE2R-AmyE-MCS整合質(zhì)粒鑒定

隨機(jī)挑取1.3.1項(xiàng)下轉(zhuǎn)化子克隆，進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果見圖2A；將上述5個(gè)單克隆擴(kuò)增菌液1mL提取質(zhì)粒，進(jìn)行AfIII/AatII雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2B。

圖2 Pbe2R-AmyE-MCS菌落PCR鑒定（A）及陽(yáng)性菌落質(zhì)粒雙酶切鑒定（B）Fig. 2 Identification of Pbe2R-AmyE-MCS integrated plasmids by PCR (A) and double-enzyme digestion of plasmids for positive colony (B)

由圖2A可知，10個(gè)陽(yáng)性單克隆中有5個(gè)克隆PCR片段大小在500 bp左右，符合預(yù)期大小。由圖2B可知，5個(gè)單克隆質(zhì)粒中，其中泳道3雙酶切片段符合預(yù)期大小（小段600 bp左右），初步表明pBE2R-AmyE-MCS克隆成功，將泳道3質(zhì)粒對(duì)應(yīng)菌株命名為BL-pBE2R-AmyE-MCS3。

2.2 pBE2R-Sugar phosphate isomerase-MCS整合質(zhì)粒鑒定

隨機(jī)從1.3.1項(xiàng)下青霉素平板上隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性單克隆菌落，進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果見圖3A；進(jìn)一步擴(kuò)增4個(gè)單克隆菌落菌液5 mL，取1 mL提取質(zhì)粒進(jìn)行AfIII/AatII雙酶切鑒定雙酶切鑒定，結(jié)果見圖3B。

圖3 pBE2R-Sugar phosphate isomerase-MCS整合質(zhì)粒PCR鑒定（A）及陽(yáng)性菌落質(zhì)粒雙酶切鑒定（B）Fig. 3 Identification of pBE2R-Sugar phosphate isomerase-MCS integrated plasmids by PCR (A) and double restrictionenzyme digestion of plasmids for positive colony (B)

由圖3A可知，10個(gè)單克隆菌落中，有4個(gè)克隆PCR擴(kuò)增片段大小在500 bp左右符合預(yù)期。由圖3B可知，4個(gè)菌落PCR陽(yáng)性克隆中，只有1個(gè)克隆的pBE2R-Sugar phosphate isomerase-MCS質(zhì)粒被AfIII/AatII切開，且片段大小約600 bp，符合預(yù)期，初步表明pBE2R-Sugar phosphate isomerase-MCS構(gòu)建成功，將泳道1對(duì)應(yīng)菌株命名為BL-pBE2R-Sugar phosphate isomerase-MCS1。

2.3 pBE2R-AmyE-SigA整合型表達(dá)載體的構(gòu)建

將合成的SigA表達(dá)盒經(jīng)HindIII/BamHIII雙酶切純化產(chǎn)物，經(jīng)連接至經(jīng)同樣雙酶切的pBE2R-AmyE-MCS整合型穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BL21進(jìn)行抗性篩選，隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果見圖4A；進(jìn)一步培養(yǎng)2個(gè)單克隆菌株菌液5 mL，提取質(zhì)粒進(jìn)行HindIII/BamHI雙酶切鑒定，結(jié)果見圖4B。

圖4 pBE2R-AmyE-SigA整合質(zhì)粒鑒定PCR鑒定（A）及陽(yáng)性菌落質(zhì)粒雙酶切鑒定（B）Fig .4 Identification of pBE2R-AmyE-SigA integrated plasmids by PCR (A) and double restriction-enzyme digestion of plasmids for positive colony (B)

由圖4A可知，2、8泳道PCR產(chǎn)物DNA片段約為1 400 bp左右，符合目的片段大小，因此，初步篩選出菌株2（A1）和菌株8（A7）將進(jìn)行進(jìn)一步篩選。由圖4B可知，A1菌株質(zhì)粒經(jīng)酶切的片段大小在1 400 bp左右，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，初步表明pBE2R-AmyE-SigA整合型表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB整合型表達(dá)載體的構(gòu)建

將合成的SigB表達(dá)盒經(jīng)HindIII/BamHIII雙酶切連接至經(jīng)同樣雙酶切的pBE2R-sugar phosphatase-MCS整合型穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BL進(jìn)行抗性篩選，隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果見圖5A；挑7、8泳道陽(yáng)性克隆培養(yǎng)5 mL菌液，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖5B。

由圖5A可知，10個(gè)陽(yáng)性克隆中，有2個(gè)克?。˙7、B8）PCR產(chǎn)物大小1 000 bp左右，符合預(yù)期；由圖5B可知，2個(gè)克隆質(zhì)粒經(jīng)雙酶切的片段大小在1 000 bp左右，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，初步表明pBE2R-sugar phosphate-SigB整合型表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.5 pBE2R-AmyE-SigA和pBE2R-Sugarphosphateisomerase-SigB整合表達(dá)L.fusiformis菌株的建立

挑取1.3.3項(xiàng)下菌株A1、B7、B8單克隆至5 mLLB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液吸光度值為1.5時(shí)，提取質(zhì)粒，置于4 ℃?zhèn)溆?。?.3.3項(xiàng)下方法分別對(duì)pBE2R-AmyE-SigA、pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB質(zhì)粒對(duì)L.fusifromis感受態(tài)菌株的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化菌株的篩選，結(jié)果見圖6。

圖5 pBE2R -Sugar phosphate-SigB整合質(zhì)粒PCR鑒定（A）及陽(yáng)性菌落質(zhì)粒雙酶切鑒定（B）Fig. 5 Identification of pBE2R-Sugar phosphate-SigB integrated plasmids by PCR (A) and double-enzyme digestion of plasmids for positive colony (B)

圖6 pBE2R-AmyE-SigA（A）及pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB（B）轉(zhuǎn)化菌株Fig. 6 Transformation strain of pBE2R-AmyE-SigA (A) and pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB (B)

由圖6可知，兩種單整合轉(zhuǎn)化方式在篩選平板上均有菌株生長(zhǎng)，分別挑取圖6陽(yáng)性克隆各10個(gè)，提取細(xì)菌基因組總DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖7。

圖7 pBE2R-AmyE-SigA和pBE2R-Sugar phosphate-SigB整合質(zhì)粒陽(yáng)性菌株菌落PCR鑒定Fig. 7 Identification of integrated plasmids pBE2R-AmyE-SigA and pBE2R-Sugar phosphate-SigB positive strains by colony PCR

由圖7可知，分別有2和3個(gè)克隆擴(kuò)增得到預(yù)期大小的SigA基因（1 400 bp左右）和SigB（1 000 bp左右）基因片段，將獲得預(yù)期大小SigA和SigB片段的克隆分別命名為pBE2RAmyE-SigA1、pBE2R-AmyE-SigA2、pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB1、pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB2和pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB3菌株（分別簡(jiǎn)稱為SigA1、SigA2、SigB1、SigB2、SigB3）。

挑取單整合菌株至5 mL乙酸鈉培養(yǎng)基中，pH4、乙醇含量6%、36 ℃、0.07 MPa條件下培養(yǎng)15 d，取上清，進(jìn)行氣相色譜分析，平行測(cè)定3次，測(cè)得的己酸含量結(jié)果如表2。

表2 單整合菌株的產(chǎn)己酸鑒定Table 2 Identification of the caproic acid production in single integrated strains

采用SPSS 22.0對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，整合組所有菌株己酸產(chǎn)量均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明抗性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)了其功能；SigA1和SigA2之間，差異顯著（P=0.024＜0.05），SigA1比SigA2顯著低；SigB1顯著低于SigB2、SigB3（P＜0.01），但SigB2與SigB3之間差異不顯著（P=0.088＞0.05），SigB3高于SigB2?；诖?，本研究選擇SigA2、SigB3整合組菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.6 pBE2R-AmyE-SigA和pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB雙整合型表達(dá)菌株的建立

挑取高產(chǎn)SigA2、SigB1菌株制備感受態(tài)，按1.3.4項(xiàng)下方法分別進(jìn)行pBE2R-AmyE-SigA、pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB質(zhì)粒對(duì)SigA2、SigB3整合組菌株感受態(tài)菌株的轉(zhuǎn)化，結(jié)果見圖8。

圖8 雙整合轉(zhuǎn)化菌株Fig. 8 Double-integrated transformation strain

由圖8可知，兩種雙整合轉(zhuǎn)化方式在篩選平板上均有菌株生長(zhǎng)，分別挑取pBE2R-AmyE-SigA對(duì)SigB3的轉(zhuǎn)化菌株和pBE2R-Sugar phosphate isomerase-SigB對(duì)SigA2的轉(zhuǎn)化菌株各10株，對(duì)表達(dá)盒SigA或表達(dá)盒SigB采用表1中表達(dá)盒引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果見圖9。

由圖9A和9B可知，各有1個(gè)克隆PCR產(chǎn)物中同時(shí)獲得了預(yù)期大小基因片段（SigA為1 400 bp左右；Sig B為1 000 bp），該結(jié)果初步表明，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了2株SigA和SigB雙整合表達(dá)盒菌株，分別命名為SigA-SigB7和SigA-SigB4。

圖9 SigA和SigB雙整合轉(zhuǎn)化菌株P(guān)CR鑒定Fig. 9 Identification of SigA and SigB double-integrated transformed strains by PCR

分別挑取2個(gè)雙整合菌株至5 mL乙酸鈉培養(yǎng)基中，pH 4、乙醇含量6%、36 ℃、0.07 MPa條件下培養(yǎng)15 d，每組3個(gè)重復(fù)，取上清，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定，結(jié)果見表3。

采用SPSS22.0對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，所有雙重組菌株己酸產(chǎn)量均顯著高于出發(fā)菌L.fusiformis（P＜0.01），單重組菌極顯著低于雙重組菌株（P＜0.01）；單重組菌間SigA2極其顯著低于SigB3（P＜0.01），雙重組菌株間SigASigB7極顯著低于SigA-SigB4（P＜0.01），在pH 4、乙醇體積分?jǐn)?shù)6%條件下，雙整合重組菌SigA-SigB4比單重組菌SigB3己酸產(chǎn)量提高了1.17倍，比非重組出發(fā)株L.fusiformis提高了8.97倍。

表3 雙整合菌株的抗脅迫篩選Table 3 Screening of double-integrated strains for stress resistance

2.7 雙重組菌株的穩(wěn)定性鑒定

挑取SigA-SigB4單菌落，按1.3.5項(xiàng)下方法進(jìn)行穩(wěn)定性鑒定，具體形態(tài)結(jié)果見圖10，產(chǎn)己酸性能結(jié)果見表4。

圖10 雙重組菌株SigA-SigB4形態(tài)穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig. 10 Stability tests of double-integrated strain SigA-SigB4 in morphology

表4 雙重組菌株SigA-SigB4產(chǎn)己酸穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 4 Stability tests of double-integrated strain SigA-SigB4 in caproic acid-production

對(duì)表4中己酸產(chǎn)量采用SPSS軟件包中成對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，出發(fā)菌SigA-SigB4傳代32代后，其產(chǎn)己酸效能無(wú)顯著差異（P＞0.05）。取0.5 mL 30代15 d培養(yǎng)SigASigB4菌液，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，采用Clustal Omega（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）在線多重序列比對(duì)工具，將設(shè)計(jì)序列與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見圖11。

由圖11A可知，對(duì)SigA-SigB4菌株中SigA表達(dá)盒進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)序列SigA相比，SigA-SigB4菌株中SigA表達(dá)盒中有3個(gè)堿基發(fā)生了改變，即298（C→G）、711（A→T）、1007（T→A）；從圖11B可知，SigA-SigB4菌株中SigB表達(dá)盒發(fā)生了2個(gè)堿基突變：179（A→T）和462（C→G）。

圖11 表達(dá)盒設(shè)計(jì)與SigA-SigB4菌株測(cè)序DNA序列比對(duì)Fig. 11 Alignment of designed DNA sequences in expression box and sequencing in double-integrated strain SigA-SigB4

圖12 表達(dá)盒設(shè)計(jì)與SigA-SigB4菌株測(cè)序氨基酸序列比對(duì)Fig. 12 Alignment of designed amino acid sequence in expression box and sequencing in double-integrated strain SigA-SigB4

采用NCBI基因序列翻譯工具orffinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），將設(shè)計(jì)和測(cè)序表達(dá)盒DNA序列，翻譯成氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果見圖12。

由圖12A可知，SigA-SigB4菌株中SigA表達(dá)盒表達(dá)的σ70與設(shè)計(jì)序列相比，發(fā)現(xiàn)在有2個(gè)突變，23位的F（苯丙氨酸）→L（亮氨酸），162位M（蛋氨酸）→L（亮氨酸）；由圖12B可知，SigA-SigB4菌株中SigB表達(dá)盒表達(dá)的σB與設(shè)計(jì)序列相比無(wú)突變。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)構(gòu)建了用于L.fusiformis菌株α-淀粉酶和蔗糖磷酸化酶的定點(diǎn)整合質(zhì)粒pBE2R-AmyE-MCS和pBE2R-sugar isome-MCS，并利用其在L.fusiformisα-淀粉酶基因、蔗糖磷酸化酶基因基因位點(diǎn)定點(diǎn)敲入了抗性調(diào)節(jié)基因SigA和SigB及其啟動(dòng)子序列，構(gòu)建了雙元整合菌株SigA-SigB2，該菌株在pH4和乙醇含量6%時(shí)，其己酸產(chǎn)量達(dá)到360.86 mg/100 mL，是單整合菌株SigB3的1.17倍，非重組出發(fā)菌株的8.97倍，且經(jīng)過(guò)32代傳代后，其高效產(chǎn)己酸效能無(wú)顯著變化；因此，本試驗(yàn)成功選育了滿足生產(chǎn)需要的高抗性高效發(fā)酵的穩(wěn)定型己酸菌。