譚 沙，雷 孝，翁 盼，趙克芳，田 怡，陳雪英，張艷丹，朱仁威

（1.銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁554300；2.佛山科技技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山556300）

刺葡萄（Vitis davidiivar.davidii）是葡萄屬東亞群下的一個(gè)種，為我國(guó)南方主要野生普通品種之一[1]，是我國(guó)特有的珍貴野生葡萄品種[2]。由于刺葡萄的枝條上密布皮刺，故稱(chēng)刺葡萄[3]。刺葡萄對(duì)于生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性非常強(qiáng)，具有較好的高溫、高濕耐受性，抗病能力強(qiáng)，栽培上施用農(nóng)藥較少，深得消費(fèi)者喜愛(ài)[4]?！白锨铩笔菑奈覈?guó)南方野生刺葡萄資源中選育出來(lái)的栽培品種[5-6]，與其他葡萄相比，刺葡萄果粒小、果皮厚，酸度高，其適合于加工成其他產(chǎn)品，而目前刺葡萄大多數(shù)主要用于鮮食[7-8]，存在附加值低、產(chǎn)品單一的問(wèn)題。目前釀酒技術(shù)中，多數(shù)以引入酵母釀造，但引入酵母由于外界條件的變化，在刺葡萄酒釀造過(guò)程中并不一定能完全表現(xiàn)出其優(yōu)良性狀，或不能完全體現(xiàn)產(chǎn)地刺葡萄酒的品質(zhì)和特色[9-10]。王瑞琛等[11]從自然發(fā)酵刺葡萄酒中篩選得到1株發(fā)酵性能良好的酵母菌株，而由于地域的差異，刺葡萄營(yíng)養(yǎng)成分的差異，篩選的刺葡萄酒酵母并不適用于刺葡萄酒的生產(chǎn)。

基于此，本試驗(yàn)擬從銅仁區(qū)域刺葡萄種植基地的土壤中采集試驗(yàn)樣品，從中分離純化獲取酵母菌株，篩選出適合銅仁區(qū)域刺葡萄酒釀造的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），對(duì)改善刺葡萄酒品質(zhì)有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

刺葡萄園土壤樣品：貴州省銅仁市川硐鎮(zhèn)塢泥刺葡萄園。

1.1.2 試劑

乙醇（分析純）：山西艷陽(yáng)升華有限公司；無(wú)水葡萄糖、檸檬酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；偏重亞硫酸鉀（分析純）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；氯化鈉（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液（固）體培養(yǎng)基、WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150恒溫培養(yǎng)箱：金壇市三和儀器有限公司；HZQQA恒溫振蕩培養(yǎng)箱：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱：常州普天儀器制造有限公司；YXQLS-100G高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JH-1超凈工作臺(tái)：安徽杰克歐德實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌株的分離

稱(chēng)取10 g土樣于無(wú)菌三角瓶中，加入200 mL無(wú)菌水，28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)20 min，制成菌落懸液。在無(wú)菌操作下，使用10倍稀釋法[12-14]進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x取稀釋度為10-3、10-4、10-5的稀釋液涂布于YPD固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。以其菌落顏色、直徑大小、透明度、厚薄程度等[15]選擇典型酵母菌落，多次劃線純化，得到單菌落。將分離純化的酵母菌分別接種到Y(jié)PD斜面培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)至冰箱4 ℃保存。

1.3.2 釀酒酵母的篩選

在無(wú)菌條件下，將篩選出的酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h[16]。取0.2 mL菌液接種到WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌落的顏色、形態(tài)特征，并對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行分類(lèi)，分類(lèi)依據(jù)見(jiàn)表1[17-19]。

表1 WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上酵母菌的分類(lèi)依據(jù)Table 1 Basis of classification for yeasts on WL nutrient agar media

1.3.3 釀酒酵母耐受性研究[20-21]

將篩選得到的釀酒酵母菌株接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、12%、14%、16%、18%；葡萄糖質(zhì)量濃度分別為200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L、600 g/L；檸檬酸質(zhì)量濃度分別為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L；溫度分別為5 ℃、10 ℃、15 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃；SO2質(zhì)量濃度分別為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L的YPD液體培基，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d。分別取0.2 mL菌液接種于YPD固體培養(yǎng)基，28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)3 d，觀察并記錄平板上菌落的生長(zhǎng)情況，分別考察菌株的乙醇、糖、酸、溫度及SO2耐受性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的分離鑒定

經(jīng)過(guò)YPD平板涂布以及多次劃線培養(yǎng)后，根據(jù)其菌落顏色、直徑大小、透明度、厚薄程度，從刺葡萄園土壤中初步分離篩選得到10株酵母菌，并命名為T(mén)R-1、TR-2、TR-3、TR-4、TR-5、TR-6、TR-7、TR-8、TR-9、TR-10，其菌落形態(tài)見(jiàn)圖1A。將10株酵母菌分別接種于WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)5 d后對(duì)其菌落顏色、形態(tài)特征進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1B。

由圖1A可知，菌株TR-2、TR-3、TR-4、TR-5、TR-6、TR-7、TR-8、TR-9、TR-10這9株菌株的菌落形態(tài)均為表面光滑、濕潤(rùn)、粘稠，易挑取，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色均一、呈乳白色，其中菌株TR-2、TR-6、TR-10有酒精味散發(fā)。菌株TR-1的菌落形態(tài)表面光滑、濕潤(rùn)、易挑取、菌落質(zhì)地均勻、中央部位的顏色均一、呈淡紅色。

由圖1B可知，菌株TR-2、TR-3、TR-6、TR-7、TR-10的菌落顏色為奶油色帶綠色，菌落形態(tài)為球形突起，表面光滑，不透明、奶油狀；菌株TR-4、TR-9的菌落顏色為深綠色，菌落很小，表面光滑，不透明、黃油狀；菌株TR-1、TR-5、TR-8的菌落顏色為白色帶綠色，菌落形態(tài)為扁平、表面褶皺、粗糙、中間火山狀褶皺。參照表1，對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，將分離得到的10株酵母菌株分為3種酵母，其中，菌株TR-2、TR-3、TR-6、TR-7、TR-10均為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），菌株TR-4、TR-9均為粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe），菌株TR-1、TR-5、TR-8均為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyver）。

圖1 10株酵母菌菌株在PDA（A）及WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂（B）培養(yǎng)基上的菌落特征Fig. 1 Colony characteristics of 10 yeast strains on the PDA(A) and WL nutritional agar (B) media

表2 WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基篩選酵母分類(lèi)結(jié)果Table 2 Classification results of yeasts screened by WL nutrient agar media

2.2 釀酒酵母的耐受性研究

2.2.1 乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)

釀酒酵母對(duì)高濃度酒精脅迫的耐性是葡萄酒釀造過(guò)程中的重要特性，耐酒精能力強(qiáng)可以使釀造過(guò)程發(fā)酵完全，提高葡萄酒的酒精度[22]。酒精對(duì)細(xì)胞的抑制作用很復(fù)雜，主要表現(xiàn)在抑制酵母的增殖速度、存活性和發(fā)酵力3個(gè)方面[22]。5株釀酒酵母菌株的乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 5株酵母菌株的乙醇耐受性Table 3 Alcohol tolerance of 5 yeast strains

由表3可知，5株酵母菌株均能在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、12%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)良好。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，5株酵母菌株對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的耐受性有明顯的差異，其中菌株TR-7可在乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，菌株TR-6、TR-10可在乙醇體積分?jǐn)?shù)高達(dá)16%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。由此可知，菌株TR-6、TR-10的乙醇耐受性最好。

2.2.2 糖耐受性實(shí)驗(yàn)

葡萄酒釀造過(guò)程中，糖是酒精發(fā)酵的基質(zhì)，也是酵母賴(lài)以生存的能源物質(zhì)，但是高濃度糖會(huì)對(duì)酵母有抑制作用[8]。5株酵母菌株的糖耐受糖性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，在葡萄糖質(zhì)量濃度為200～300 g/L時(shí)，5株酵母菌株生長(zhǎng)良好，但隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加各菌株的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的差異性，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為500 g/L時(shí)，只有菌株TR-6、TR-10可以生長(zhǎng)，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為600 g/L時(shí)，只有菌株TR-10生長(zhǎng)。由此可知，菌株TR-6、TR-10的糖耐受性較好。

表4 5種酵母菌株的糖耐受性Table 4 Glucose tolerance of 5 yeast strains

2.2.3 酸耐受性實(shí)驗(yàn)

5株酵母菌株的耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 5株酵母菌株的酸耐受性Table 5 Acid tolerance of 5 yeast strains

由表5可知，當(dāng)檸檬酸質(zhì)量濃度為10～20 g/L時(shí)，5株酵母菌株均能生長(zhǎng)，且菌株TR-3、TR-6、TR-7、TR-10生長(zhǎng)良好；當(dāng)檸檬酸質(zhì)量濃度為25 g/L時(shí)，僅有菌株TR-3、TR-6、TR-10能生長(zhǎng)，且菌株TR-6、TR-10生長(zhǎng)良好；當(dāng)檸檬酸質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，僅有菌株TR-6和TR-10能生長(zhǎng)，且菌株TR-10生長(zhǎng)良好。由此可知，菌株TR-3、TR-6、TR-10的酸耐受性較好。

2.2.4 溫度耐受性實(shí)驗(yàn)

5株酵母菌株的溫度耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為5 ℃時(shí)，菌株TR-6、TR-7、TR-10可以生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)一般；當(dāng)培養(yǎng)溫度為10～35 ℃時(shí)，5株酵母菌株均能生長(zhǎng)，但隨著培養(yǎng)溫度的升高，這5株酵母菌株對(duì)高溫耐受性表現(xiàn)出一定差異，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，僅有菌株TR-3、TR-6、TR-10可以生長(zhǎng)，且菌株TR-6生長(zhǎng)良好；當(dāng)培養(yǎng)溫度為55 ℃時(shí)，所有菌株均不能生長(zhǎng)。由此可知，菌株TR-6和TR-10既可在低溫為5 ℃條件下生長(zhǎng)，又可耐受45 ℃，溫度耐受性較好。

表6 5株酵母菌株的溫度耐受性Table 6 Temperature tolerance of 5 yeast strains

2.2.5 SO2耐受性實(shí)驗(yàn)

在葡萄酒釀過(guò)程中，添加適量SO2的目的是抑制有害微生物的生長(zhǎng)、阻止葡萄汁的氧化作用、加速膠體的凝集以及有利于葡萄汁澄清，在釀造過(guò)程中被廣泛使用[9]。5株酵母菌株的SO2耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為100～200 mg/L時(shí)，5株菌株均生長(zhǎng)良好；當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為250 mg/L時(shí)，菌株TR-3不能生長(zhǎng)；當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)，只有菌株TR-10可以生長(zhǎng)。由此可知，菌株TR-2、TR-6、TR-7、TR-10這四株的SO2耐受性較強(qiáng)。

表7 5株酵母菌株的SO2耐受性Table 7 SO2 tolerance of 5 yeast strains

綜上，菌株TR-6和TR-10的耐受性較好，均分別能在乙醇體積分?jǐn)?shù)為16%、葡萄糖質(zhì)量濃度為500 g/L、檸檬酸質(zhì)量濃度為30 g/L、SO2質(zhì)量濃度為250 mg/L的YPD液體培養(yǎng)基和高溫45 ℃、低溫5 ℃條件下生長(zhǎng)繁殖。

3 結(jié)論

從銅仁市川硐鎮(zhèn)塢泥刺葡萄園土壤中共分離、篩選得到5株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其中菌株TR-6和TR-10的耐受性較好，均分別能在乙醇體積分?jǐn)?shù)為16%、葡萄糖質(zhì)量濃度為500 g/L、檸檬酸質(zhì)量濃度為30 g/L、SO2質(zhì)量濃度為250 mg/L的YPD液體培養(yǎng)基和高溫45 ℃、低溫5 ℃條件下生長(zhǎng)繁殖，為后續(xù)選育出適合釀造刺葡萄酒的酵母菌奠定基礎(chǔ)，對(duì)今后釀造具有獨(dú)特風(fēng)格的刺葡萄酒及促進(jìn)銅仁地區(qū)的刺葡萄資開(kāi)發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有非常重要的意義。