劉曉柱，張遠(yuǎn)林，李銀鳳，于志海，劉曉輝，黃名正

（貴州理工學(xué)院 食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽550000）

刺梨（Rosa roxburghii）是一種廣泛分布于我國西南地區(qū)的薔薇科、薔薇屬植物，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。但刺梨果實(shí)中酚類物質(zhì)含量較高，鮮果生食口感酸澀，比較適宜進(jìn)行精深加工，如發(fā)酵生產(chǎn)刺梨果酒、果醋等飲品[3-4]。不同種類微生物的代謝活動(dòng)，均影響著釀造酒的質(zhì)量[5]，這些微生物包括酵母菌、霉菌、細(xì)菌等[6-8]。研究表明，在果實(shí)的自然發(fā)酵過程中，除了酵母菌，醋酸桿菌屬（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）等細(xì)菌也會(huì)對(duì)發(fā)酵過程產(chǎn)生重要影響。如乳酸菌的異常代謝，可產(chǎn)生多種揮發(fā)酸；醋酸菌的甘油代謝、糖代謝和酒精的醋化，都會(huì)引起葡萄酒的病害[9-12]；葡糖桿菌屬細(xì)菌可產(chǎn)生乙酸，影響葡萄酒的感官品質(zhì)[13]。謝丹等[14]采用高通量測序技術(shù)分析了刺梨果渣自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性。張?jiān)吹萚15]基于高通量測序分析了草莓酒發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落特征，發(fā)現(xiàn)歐文氏菌屬（Erwinia）、檸檬酸菌屬（Citrobacter）、乳酸球菌屬（Lactococcus）、泛菌屬（Pantoea）以及未知屬細(xì)菌在草莓酒的發(fā)酵過程中動(dòng)態(tài)變化，且與酒體特征相關(guān)。本研究采用高通量測序技術(shù)，解析刺梨自然發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群多樣性及其動(dòng)態(tài)變化，對(duì)優(yōu)質(zhì)刺梨釀造菌種的選育及控制發(fā)酵酒的品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

刺梨（Rosa roxburghii），品種為貴龍5號(hào)，采購于2019年9月份貴州龍里地區(qū)，平均單果質(zhì)量（22.26±0.82）g，糖度（9.89±0.23）°Bx，pH值為3.58±0.11。

1.1.2 化學(xué)試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：美國MP Biomedicals公司；Pfu高保真DNA聚合酶（100 U/管）：北京TransGen Biotech有限公司；瓊脂糖凝膠：西班牙Biowest公司；DNA Marker：生工生物工程（上海）股份有限公司；引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：上海美吉生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

N13462C移液器、5430 R小型離心機(jī)：德國Eppendorf公司；ABSON MiFly-6微型離心機(jī)：合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)：美國Thermo Fisher Scientific公司；GeneAmpR9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Illumina Miseq測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨自然發(fā)酵

取新鮮、成熟、無霉?fàn)€的貴農(nóng)5號(hào)刺梨，用無菌水沖洗果實(shí)表面泥沙，切碎，置于無菌1 L三角瓶中。28 ℃進(jìn)行靜置自然發(fā)酵，在自然發(fā)酵的1 d、3 d、5 d、15 d分別取樣1 mL，命名為F1、F3、F5、F15，每個(gè)樣本3個(gè)平行重復(fù)，保存于-80 ℃冰箱用于高通量測序。

1.3.2 高通量測序與生物信息學(xué)分析[16-18]

按照試劑盒說明書提取刺梨自然發(fā)酵液中細(xì)胞基因組脫氧核糖核酸（DNA），利用NanoDrop2000進(jìn)行DNA純度與濃度檢測，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA完整性檢測。取適量的DNA模板，以338F和806R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因，PCR擴(kuò)增體系為5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphos phate，dNTPs）2 μL，5 μmol/L 338F引物0.8 μL，5 μmol/L 806R引物0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，補(bǔ)水至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后，進(jìn)行回收和純化。文庫的構(gòu)建與Miseq測序由深圳微生太科技有限公司完成。

Miseq測序得到的序列，在深圳微生太平臺(tái)上進(jìn)行數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。首先，根據(jù)取樣的時(shí)間和方式，把測序數(shù)據(jù)的樣本分為自然發(fā)酵1 d樣本（F1）、自然發(fā)酵3 d樣本（F3）、自然發(fā)酵5 d樣本（F5）和自然發(fā)酵15 d樣本（F15）共4組，每組3個(gè)平行重復(fù)。然后，按照相似度為97%，按照最小樣本序列數(shù)抽評(píng)樣本序列，運(yùn)用QIIME2 dada2插件對(duì)測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，修剪，去噪，拼接及去除嵌合體。運(yùn)用QIIME2 feature-classifier插件將代表序列與GREENGENES數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得物種分類信息表。采用QIIME2 core-diversity插件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)。采用PCoA和NMDS圖展示Beta多樣性指數(shù)?；跇颖局兄饕⑸镂锓N相對(duì)豐度分析，采用共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析（co-occurrence analysis）計(jì)算斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)，從而了解物種之間的關(guān)聯(lián)。PICRUSt軟件預(yù)測微生物群體可能的功能組成[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定

刺梨自然發(fā)酵不同階段的樣品中細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知，刺梨自然發(fā)酵4個(gè)階段（F1、F3、F5和F15）12個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶特異性和亮度均較好，可滿足下一步的測序需求。

圖1 刺梨自然發(fā)酵液樣品中細(xì)菌群落16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplified product of bacterial community in nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

2.2 測序樣本數(shù)據(jù)分析

刺梨自然發(fā)酵液4個(gè)階段的樣本，經(jīng)過測序樣本數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表1。由表1可知，共得到230 692條讀數(shù)，經(jīng)質(zhì)量控制（過濾、去噪、去嵌合體）后共得到150 385條有效序列，序列的平均堿基長度約500 bp。

表1 刺梨自然發(fā)酵液樣品測序樣本讀數(shù)結(jié)果Table 1 Results of sequencing sample reads of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

2.3 Alpha多樣性分析

稀釋曲線可用于驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)量是否滿足反映樣品中物種多樣性的需求，刺梨自然發(fā)酵液樣品的稀釋曲線見圖2。由圖2可知，刺梨自然發(fā)酵液4個(gè)樣品細(xì)菌操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）圖平緩性較好，能夠反映樣本中絕大部分細(xì)菌菌落特征和多樣性信息。稀釋曲線還可以間接反映樣品中物種的豐富度，結(jié)果表明，F(xiàn)1樣品中細(xì)菌多樣性最大，4個(gè)樣品中細(xì)菌豐富度程度大小為F1＞F15＞F3＞F5。

圖2 刺梨自然發(fā)酵液樣品稀釋曲線Fig. 2 Dilution curve of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

Shannon指數(shù)可綜合衡量樣本中的物種多樣性，通常Shannon指數(shù)數(shù)值越大，表示樣本中物種的多樣性越高，反之，則樣本中物種多樣性越低。刺梨自然發(fā)酵樣品Alpha多樣性指數(shù)指數(shù)結(jié)果見表2。

表2 刺梨自然發(fā)酵液樣品Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indexes of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

由表2可知，樣品F1的Shannon指數(shù)和OTU數(shù)均最大，說明樣本F1中物種多樣性最豐富。比較4個(gè)樣本的Shannon指數(shù)和OTU數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，隨著刺梨自然發(fā)酵的進(jìn)行，樣品中細(xì)菌多樣性表現(xiàn)出先逐漸降低，再增加的趨勢。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)也可用來衡量樣本中的物種的種類。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)越大，則樣本中物種種類越多。由表2可知，在刺梨自然發(fā)酵樣本中，樣本F1的Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均最大。

2.4 物種組成

基于OTU的絕對(duì)豐度及注釋信息，對(duì)每個(gè)樣品在界、門、綱、目、科、屬、種7個(gè)分類水平上的序列數(shù)目占總序列數(shù)的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以有效的評(píng)估樣本的物種注釋分辨率。每個(gè)樣本中OTU在各分類水平注釋的相對(duì)程度結(jié)果見圖3。刺梨發(fā)酵液各樣本細(xì)菌菌群屬水平分布Venn圖見圖4，屬水平細(xì)菌菌群相對(duì)豐度見圖5。

由圖3可知，在門水平上，刺梨自然發(fā)酵過程中共檢測到變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）等8個(gè)門的細(xì)菌類，優(yōu)勢細(xì)菌門為Proteobacteria，占98.66%；在刺梨自然發(fā)酵的前期，包括樣品F1、F3和F5中基本上未檢測到厚壁菌門（Firmicutes）菌群，但在發(fā)酵后期的樣品F15中，厚壁菌門（Firmicutes）的比例達(dá)到5.26%，暗示其在刺梨自然發(fā)酵的后期發(fā)揮作用。

圖3 刺梨自然發(fā)酵液樣品序列注釋程度Fig. 3 Sequence annotation degree of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

圖4 刺梨自然發(fā)酵液各樣本細(xì)菌菌群屬水平分布Venn圖Fig. 4 Venn diagram of bacteria community distribution at the genus level of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

圖5 刺梨自然發(fā)酵液各樣本屬水平細(xì)菌菌群相對(duì)豐度Fig. 5 Relative abundance of bacteria community of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii at the genus level

由圖4可知，在屬水平，樣品F1特有屬40種，樣品F3特有屬6種、樣品F5特有屬5種，樣品F15特有屬11種；4個(gè)樣本共有屬14種。

由圖5可知，隨著刺梨發(fā)酵的不斷進(jìn)行，葡糖桿菌屬細(xì)菌（Gluconobacter）表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢；弗拉托氏菌屬（Frateuria）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、塔特姆菌屬（Tatumella）在刺梨發(fā)酵過程中含量逐漸降低；而醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、酒酒球菌屬（Oenococcus）細(xì)菌含量在發(fā)酵過程中含量不斷增加。表明隨著刺梨自然發(fā)酵的不斷進(jìn)行，參與糖代謝相關(guān)菌群量逐漸降低，而參與酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵以及醋酸發(fā)酵相關(guān)菌群量逐漸增加。

2.5 樣本比較分析

LEfSe法是非參數(shù)檢驗(yàn)和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）的結(jié)合，適合菌群豐度差異檢驗(yàn)。由圖6可知，在刺梨自然發(fā)酵的樣品F1中，菌群總體豐度較高，且甲基桿菌屬（Methylobacterium）、弗拉托氏菌屬（Frateuria）、痰塔特姆氏菌（Tatumella）、拉恩氏菌屬（Rahnella）、黃單胞菌屬（Xanthomonadaceae）、腸桿菌屬（Enterobacter）等菌屬在樣品F1中分布較為特異性；在發(fā)酵終點(diǎn)樣品F15中，醋酸桿菌屬（Acetobacter）菌群豐度較高，較為特異性。

圖6 刺梨自然發(fā)酵液樣品細(xì)菌菌群LEfSe法線性判別分析Fig. 6 Linear discriminant analysis of bacteria community of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii by LEfSe method

2.6 功能分析

基于KEGG功能注釋的方法分析刺梨自然發(fā)酵過程中各菌群的功能特性，結(jié)果見圖7。由圖7可知，在發(fā)酵過程中，菌群中與細(xì)胞處理（Cellular Processes）相關(guān)過程和環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）過程逐漸降低；而與代謝（Metabolism）相關(guān)、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）過程逐漸增加。

圖7 刺梨自然發(fā)酵液樣本菌群功能分析Fig. 7 Functional analysis of bacteria community of nature fermentation liquid samples of Rosa roxburghii

3 結(jié)論

本研究基于高通量測序技術(shù)的研究結(jié)果表明，在刺梨發(fā)酵的起始階段微生物多樣性最高，隨著刺梨果實(shí)發(fā)酵的不斷進(jìn)行，葡糖桿菌屬細(xì)菌（Gluconobacter）表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢；弗拉托氏菌屬（Frateuria）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、塔特姆菌屬（Tatumella）細(xì)菌在刺梨發(fā)酵過程中含量逐漸降低；而醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、酒酒球菌屬（Oenococcus）細(xì)菌含量在發(fā)酵過程中含量不斷增加。通過高通量技術(shù)較為全面的掌握了刺梨自然發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性及其菌群結(jié)構(gòu)變化，為后續(xù)進(jìn)行優(yōu)質(zhì)刺梨釀造菌種的選育奠定了基礎(chǔ)。