李仁芳，蒙曉明，黃福衛(wèi)，孫 寧*，黃 麗，楊 攀，李 玲

（1.皇氏集團(tuán)華南乳品有限公司，廣西 南寧530000；2.廣西水牛乳工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧530000；3.廣西壯族自治區(qū)水牛乳質(zhì)量與安全控制技術(shù)工程研究中心，廣西 南寧530001；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西水牛研究所，廣西 南寧530001）

生榨米粉是廣西地區(qū)具有地方特色的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其一般以秈米為原料，經(jīng)過浸泡、磨漿、自然發(fā)酵等工序，再將發(fā)酵好的米粉團(tuán)人工壓榨成細(xì)條狀，煮熟后即可食用。和普通米粉相比，經(jīng)過發(fā)酵后的生榨米粉口感爽滑筋道，且具有獨(dú)特的酸香味，深受廣大消費(fèi)者所喜愛。2015年，生榨米粉被選入南寧市第六批市級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄，2016年被廣西烹飪餐飲行業(yè)協(xié)會列為廣西十大米粉之一[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌是米粉發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群，并且是米粉性狀風(fēng)味發(fā)生改變的關(guān)鍵因素[2-3]。

鮮米粉發(fā)酵過程中的微生物種類具有多樣性，李蕓[4]從米粉浸泡發(fā)酵過程中篩選得到32株發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、6株植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、1株熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）和1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），確定枯草芽孢桿菌作為優(yōu)勢菌；閔偉紅等[5]從發(fā)酵米粉中篩選出一株桿狀乳酸菌用于改善米粉的品質(zhì)；李路遙[6]篩選得到大米發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、唾液鏈球菌（Streptococuus salivarius）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；KOBAYASHI A等[7]研究發(fā)現(xiàn)，泰國發(fā)酵米粉中含有芽孢桿菌、酵母、霉菌和乳酸菌等微生物；UCHIMURA T等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌占總米粉分離細(xì)菌的40%～60%，典型的球菌有乳鏈球菌（Streptococcus lactis）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）及乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），桿菌主要有嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophillus）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）及羅伊乳桿菌（Lactobacillusreuteri）。由此可見，傳統(tǒng)發(fā)酵米粉中存在著優(yōu)良的自然乳酸菌菌株，可以作為功能乳酸菌的篩選資源，而廣西生榨米粉作為省內(nèi)尤其在首府南寧深受消費(fèi)者喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，對其功能乳酸菌的分離和益生特性分析鮮有報道，因此挖掘和分析生榨米粉中優(yōu)勢乳酸菌，可為豐富傳統(tǒng)發(fā)酵食品源有益微生物菌菌種庫及其利用提供技術(shù)支持。

本研究以廣西傳統(tǒng)發(fā)酵食品生榨米粉為材料，對其中所含有的乳酸菌進(jìn)行分離、篩選和鑒定，并對不同菌株的益生特性進(jìn)行檢測，以期獲得具有潛在工業(yè)化應(yīng)用價值的優(yōu)良乳酸菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

生榨米粉采集自廣西南寧市周邊的3個生榨米粉作坊，來源編號為XC、FD、PM。

1.1.2 化學(xué)試劑

放線菌酮（分析純）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：美國Sigma Aldrich公司；凝膠瓊脂（分析純）：上海玉博科技有限公司；DL 2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：日本Takara公司；Chelex-100純化DNA提取試劑盒：美國Bio-Rad公司；細(xì)菌通用引物27f、1492r：蘇州金唯智生物科技有限公司；2×EsTaqMasterMix（含染料）：康為世紀(jì)生物科技有限公司；氯化鈉、碳酸鈣、氫氧化鈉、濃鹽酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯乙酸、30%過氧化氫、鄰二氮菲（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；牛膽鹽（分析純）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biotek Epoch2微孔板分光光度計：美國伯騰儀器有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PB-10 pH計：德國賽多利斯集團(tuán)；SW-CJ-2F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YM 50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)、LP Vortex Mixer旋渦振蕩器：美國賽默飛世爾科技公司；DYY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；BIO-RAD C1000 Touch cthemal聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；Ose-470p便攜式藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)：天根生化科技（北京）有限公司；ME204E分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；C21-SDHCB39電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

無菌條件下，稱取生榨米粉團(tuán)核心部分樣品10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，渦旋振蕩制備均勻懸濁液。采用無菌生理鹽水依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得10-2～10-7濃度的稀釋樣品。分別取10-3～10-7稀釋度的樣品各0.1 mL涂布于含有0.01%放線菌酮和2%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下恒溫厭氧培養(yǎng)至長出菌落。采用接種環(huán)挑取有溶鈣圈的單菌落在MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化3次。觀察純化后的菌落形態(tài)，并對菌株進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶反應(yīng)實驗和測定發(fā)酵液pH值。

1.3.2 乳酸菌供試菌液的制備

取待測乳酸菌凍存菌液100 μL接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，裝液量6 mL/13 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。按2%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，裝液量6 mL/13 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，活化至3代，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）調(diào)整菌體濃度為1.0×108CFU/mL。

1.3.3 乳酸菌溶血性實驗

將供試菌液劃線于含有5%脫纖維羊血的血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察平板上菌落生成情況。

1.3.4 乳酸菌耐受性實驗

（1）乳酸菌耐酸性實驗

將供試菌液以2%（V/V）的接種量分別接種于pH值為2.0、2.5的MRS肉湯培養(yǎng)基中，裝液量6 mL/13 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，同時測定其發(fā)酵液在波長595 nm處的吸光度值[9]，觀察平板上是否有菌落生成。以未添加供試菌液為對照組，結(jié)果以實驗組與對照組的吸光度差值表示。

（2）乳酸菌的膽鹽耐受能力測定

將供試菌液以2%（V/V）的接種量接種于含有0.3%牛膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基中，裝液量6 mL/13 mL，同時將供試菌液涂布于含有0.3%牛膽鹽的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定其發(fā)酵液在波長630 nm處的吸光度值[9]，并觀察固體平板上是否有菌落生成。以未添加供試菌液為對照組，結(jié)果以實驗組與對照組的吸光度差值表示。

1.3.5 乳酸菌的體外抗氧化能力測定

樣品處理：供試菌液在4 ℃條件下經(jīng)8 000 r/min離心30 min，收集發(fā)酵上清液，即為菌株胞外分泌物，用0.45 μm的濾膜過濾，放入-80 ℃冰箱保存待測。

DPPH自由基清除能力的測定：胞外分泌物用超純水稀釋10倍，參照文獻(xiàn)[10]所述方法進(jìn)行測定。

ABTS自由基清除能力的測定：胞外分泌物用超純水稀釋10倍，參照文獻(xiàn)[11]所述方法進(jìn)行測定。

羥自由基的清除能力測定：胞外分泌物用超純水稀釋2倍，參照文獻(xiàn)[12]所述方法進(jìn)行測定。

超氧陰離子自由基的清除能力測定：胞外分泌物用超純水稀釋2倍，參考文獻(xiàn)[13]所述方法進(jìn)行測定。

還原能力測定：胞外分泌物用超純水稀釋5倍，參考文獻(xiàn)[14]所述方法進(jìn)行測定。

1.3.6 乳酸菌生長和產(chǎn)酸曲線的測定

將供試菌液以2%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，裝液量6 mL/13 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h測定各菌種發(fā)酵液的pH值及OD595nm值，并繪制產(chǎn)酸曲線和生長曲線。

1.3.7 乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

采用Chelex-100法[15]提取純菌株的基因組DNA，以其為模板，參照文獻(xiàn)[16]的方法對篩選菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Ose-470p便攜式藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)成像，委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)DNA Star軟件整理，利用數(shù)據(jù)庫EzBioCloud（http：//www.eztaxon.org/）進(jìn)行在線比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用Mega5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.8 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和采用Duncan進(jìn)行單因素方差分析，通過origin 9.1繪制圖表，每個實驗進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

經(jīng)過初步篩選，從3份不同來源的生榨米粉樣品中共分離獲得146株菌株，其中桿菌104株，球菌42株。所有菌株均無芽孢、革蘭氏染色均呈陽性、過氧化氫酶試驗均呈陰性，發(fā)酵液pH值為3.70～4.30，參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》[17]初步鑒定這146株菌為乳酸菌。

2.2 乳酸菌的溶血性

對146株乳酸菌進(jìn)行溶血試驗，結(jié)果顯示均為γ-溶血，可用于益生菌的篩選。

2.3 乳酸菌的耐受性

通過耐酸試驗和耐膽鹽試驗，從146株乳酸菌中篩選出綜合耐受能力較好的22株菌株，其耐受性結(jié)果見表1。

表1 22株菌株的耐受性結(jié)果Table 1 Tolerance results of 22 strains

根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)的不同，人體胃部的pH值維持在3.0左右[18]。此強(qiáng)酸環(huán)境下可抑制或殺死乳酸菌，而乳酸菌到達(dá)腸道前，必先經(jīng)過胃酸環(huán)境。因此益生菌在人體胃液的條件下是否存活對其是否能夠到達(dá)腸道起著決定性作用[19]。由表1可知，22株菌株在pH 2.0和pH 2.5條件下均能存活，都呈現(xiàn)了較強(qiáng)的耐酸性。根據(jù)MRS平板結(jié)果并參照柳青[19]的研究得出，在pH 2.0環(huán)境中，4株菌株長勢良好，18株菌株長勢一般，其中菌株XC21的耐受性顯著低于其他菌株（P＜0.05）。在pH 2.5環(huán)境中，20株菌株長勢良好，2株菌株長勢一般，其中菌株FD18的耐受性顯著高于其他菌株（P＜0.05）。除菌株P(guān)M01和XC03外，同一菌株在pH 2.5環(huán)境中的OD595nm值都低于pH 2.0中，說明菌株在低pH條件下生長受到抑制。分析原因可能是過低pH值下，菌體無法維持自身細(xì)胞內(nèi)pH值的穩(wěn)定，從而處于低生存狀態(tài)，導(dǎo)致生長停滯，甚至衰亡[20]。

從表1亦可知，22株菌株在0.3%膽鹽條件下培養(yǎng)，OD630nm值均＞0.050，說明菌株在0.3%牛膽鹽環(huán)境中長勢良好，在添加0.3%牛膽鹽的MSR固體培養(yǎng)基上長勢非常好，菌株布滿平板，都具有很好的膽鹽耐受性。其中菌株P(guān)M01、PM25、PM15和PM05的OD630nm值＞1.6，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。不同菌株對0.3%牛膽鹽的耐受能力存在差異，分析原因可能是菌株種屬差異或生存環(huán)境長期影響所造成[21]。乳酸菌耐受膽酸鹽的能力是其能在腸道中存活的必要條件，因此耐膽酸鹽能力是益生菌微生物的一個重要特征[22]。人體小腸中膽鹽濃度在0.03%～0.30%之間波動，功能菌進(jìn)入胃腸道后需要有一定的膽鹽耐受性才可有效發(fā)揮功效[23]。本試驗中22株菌株有望在腸道消化過程中存活。

2.4 菌株的體外抗氧化能力

2.4.1 菌株胞外分泌物對DPPH和ABTS的清除能力

22株菌株的胞外分泌物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率結(jié)果見表2。

表2 22株菌株胞外分泌物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率Table 2 DPPH and ABTS free radical clearance rate of extracellular secretions of 22 strains

由表2可知，菌株P(guān)M44和FD13胞外分泌物稀釋10倍后對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均＞85%，顯著高于其他菌株（P＜0.05），表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化能力，這可能與胞外分泌物中含有胞外多糖和生物活性肽有關(guān)[24]。此外，DPPH自由基清除率較高的菌株有菌株FD18、PM20、PM22、PM25、PM33、XC08、XC15和XC21，清除率均＞65%，ABTS自由基清除率較高的菌株有菌株P(guān)M20、PM22、PM25、PM33、PM43、XC08和XC21，清除率均＞70%。除菌株P(guān)M02、FD06和PM05外，有19株菌株的胞外分泌物清除ABTS自由基能力大于清除DPPH自由基的能力，說明這些菌株對ABTS自由基清除能力更強(qiáng)。

2.4.2 菌株胞外分泌物對羥自由基和超氧陰離子的清除能力

22株菌株的胞外分泌物對羥自由基和超氧陰離子的清除率見表3。

由表3可知，22株菌株的稀釋2倍胞外分泌物均具有清除羥自由基和超氧陰離子的能力，但各菌株抗氧化能力差異較大。29株菌株胞外分泌物對羥自由基清除率均＞60%。其中羥自由基清除率＞70%的菌株共有6株，占所有菌株的27.27%，分別是菌株FD06、PM01、PM20、XC03、XC08和XC27。其中，菌株XC08胞外分泌物清除羥自由基能力最強(qiáng)（76.30%），而菌株XC15最弱（46.09%），顯著低于其他菌株（P＜0.05）。超氧陰離子清除率介于45%～55%的菌株共有20株，占所有菌株的90.9%。其中，菌株P(guān)M01（55.76%）和PM15（54.55%）胞外分泌物清除超氧陰離子能力最強(qiáng)，顯著高于其他菌株（P＜0.05），而菌株P(guān)M04最弱（41.82%），顯著低于其他菌株（P＜0.05）。乳酸菌發(fā)酵液清除羥自由基和超氧陰離子這兩者之間并沒有必然聯(lián)系，這與黃麗等[25]的研究結(jié)果相似，這也反映出菌株發(fā)揮清除自由基能力的物質(zhì)不同，表明乳酸菌抗氧化作用是多種物質(zhì)綜合作用的結(jié)果。

表3 22株菌株胞外分泌物對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率Table 3 Hydroxyl free radical and superoxide anion free radical clearance rate of extracellular secretions of 22 strains

2.4.3 菌株胞外分泌物的還原能力

22株菌株的胞外分泌物的還原能力見表4。

表4 22株菌株胞外分泌物的還原能力Table 4 Reducing capacity of extracellular secretions of 22 strains

由表4可知，菌株XC21、PM22、XC08、PM33表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力，OD700nm值均＞0.285，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。菌株FD06、PM44、XC27、FD13和PM04的還原能力較弱，OD700nm值均＜0.230，顯著低于其他菌株（P＜0.05）。

乳酸菌通過清除自由基、螯合金屬離子、抑制脂質(zhì)過氧化、耐H2O2、提高抗氧化酶活力等多種機(jī)制發(fā)揮抗氧化作用，一種體外評價方法只能根據(jù)某一種抗氧化原理評價其抵抗氧脅迫的能力，因此需要采用多種方法進(jìn)行綜合判斷[26]。綜上抗氧化結(jié)果，選取在5個抗氧化測定指標(biāo)中2個以上指標(biāo)排前五的代表菌株進(jìn)行下一步研究，即菌株DF13、PM20、PM22和PM44。

2.5 代表菌株的生長和產(chǎn)酸特性研究

2.5.1 菌株的生長特性研究

由圖1可知，4株菌株的生長趨勢一致，遲滯期為0～2 h，對數(shù)生長期為2～10 h，10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，生長速率減緩，菌種OD595nm值基本保持恒定。其中菌株P(guān)M44在整個生長周期相比其他菌種長勢較快，同時間段內(nèi)OD595nm值高于其他菌株。在整個生長周期內(nèi)，4株菌株的生長速度快慢順序為菌株P(guān)M44＞FD13＞PM22＞PM20。

圖1 4株菌株的生長曲線Fig. 1 Growth curves of 4 strains

2.5.2 菌株的產(chǎn)酸特性研究

圖2 4株菌株的產(chǎn)酸曲線Fig. 2 Acid production curves of 4 strains

由圖2可知，4株菌株的生長曲線和產(chǎn)酸曲線存在對應(yīng)關(guān)系，隨著菌種生長速率增加，產(chǎn)酸速率同時增加，產(chǎn)酸快慢的規(guī)律也和生長曲線一致。同樣的，產(chǎn)酸延滯期為0～2 h，各菌株pH值變化不大；發(fā)酵2 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體生長代謝旺盛，產(chǎn)生大量有機(jī)酸，pH值迅速下降；發(fā)酵10 h左右達(dá)到生長穩(wěn)定期，pH值變化不大，其中菌株FD13、PM22、PM20發(fā)酵菌液的最終pH值為3.8左右，而菌株P(guān)M44的最終pH值為4.0左右。綜上，菌株P(guān)M44產(chǎn)酸速率最大且產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。

2.6 代表菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株P(guān)M20、PM22、PM44及FD13的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株P(guān)M20、PM22及FD13與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）聚于一支，親緣關(guān)系最近，菌株P(guān)M44與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）聚于一支，親緣關(guān)系最近。因此，菌株P(guān)M20、PM22和FD13被鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株P(guān)M44被鑒定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

3 結(jié)論

本研究通過革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗及溶血性試驗從廣西生榨米粉中共篩選出146株γ-溶血的乳酸菌；通過耐酸、耐膽鹽性能測定篩選出22株對pH 2.0和0.3%膽鹽均具有良好耐受性的菌株；通過體外抗氧化能力測定篩選出綜合體外抗氧化能力較好的4株優(yōu)良菌株（PM20、PM22、PM44、FD13）。4株菌株生長及產(chǎn)酸趨勢一致，其中菌株FM44的生產(chǎn)速率及產(chǎn)酸速率最快。通過分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株P(guān)M20、PM22、FD13均為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、菌株P(guān)M44為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。