韓廷玉，李盼盼，劉春瑩，于 爽，遲雪梅，遲乃玉，張慶芳

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連116622；3.基因賽奧（大連）生物科技發(fā)展有限公司，遼寧 大連116622）

酯酶是指能夠催化酯鍵水解或合成的酶類，當(dāng)發(fā)生水解時，能催化酯鍵產(chǎn)生相應(yīng)的酸和醇；合成時，可以把酸的羧基與醇的羥基縮合并脫水，產(chǎn)物為酯類及其它香味物質(zhì)。甾醇酯酶（sterol esterase）又稱為膽固醇酯酶，它他泛存在于包括人在內(nèi)的高等動物、微生物等生物體內(nèi)[1]。甾醇酯酶能夠在水相條件下催化甾醇酯水解生成甾醇和脂肪酸，同時在有機(jī)溶劑中通過酯化或酯交換進(jìn)行催化酯合成反應(yīng)[2]。甾醇酯酶作為一種重要的酶制劑，可幫助機(jī)體消化吸收油脂類營養(yǎng)物質(zhì)，因其與人體脂質(zhì)代謝及膽固醇吸收有關(guān)，甾醇酯酶是檢測血液中總膽固醇含量的重要酶制劑之一[3]。同時還可解決機(jī)械制漿造紙工藝中樹脂障礙問題的潛力[4]，由于其廣泛的底物特異性和穩(wěn)定性，在食品、醫(yī)藥、紙漿工業(yè)及化工行業(yè)等發(fā)揮重要作用[5]。

自然界中，微生物生產(chǎn)的甾醇酯酶具有生產(chǎn)成本低、工藝簡單、不易污染、不受季節(jié)影響及易形成規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前研究熱點(diǎn)[6-7]。

本研究以莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）Q-06為出發(fā)菌株，對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行單因素、Plackett-Burman（PB）、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken（BB）和響應(yīng)面試驗(yàn)[9-10]。通過對最優(yōu)發(fā)酵條件的初步探究，提高酶產(chǎn)量和酶活力，以期為此海洋低溫甾醇酯酶的規(guī)?；a(chǎn)打下良好的基礎(chǔ)，并提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 出發(fā)菌株莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）Q-06 篩選自渤海海泥中，保藏于遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 試劑

可溶性淀粉：哈靈生物公司；麥芽糖、葡萄糖、氯化銨：吉林東博生物公司；蔗糖、乳糖、硝酸銨：賽德試劑公司；牛肉膏：福建明福試劑公司；辣根過氧化物酶：生工生物（上海）股份工程有限公司；膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase，COD）：上海源葉生物科技有限公司；羅丹明B：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植物甾醇酯：江蘇春之谷生物制品有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖6 g/L，K2HPO42 g/L，瓊脂粉20 g/L，單蒸水1.0 L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)：胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：植物甾醇酯0.5%，酵母粉0.3%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.03%，（NH4）2SO40.05%，葡萄糖0.5%，pH值為7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

LFX-30B Thermo酶標(biāo)儀：北京昊諾斯科技有限公司；HZP-256 全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；BA410E生物顯微鏡：麥克迪奧實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；NB-1630超凈工作臺：菲迪康樂（廣州）科學(xué)儀器有限公司；LDFX-50BI立式壓力蒸汽滅菌鍋：蘭州方盛生物科技有限公司；PHS-3E雷磁pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-H232可見紫外分光光度計：菲迪康樂（廣州）科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將菌株Q-06接種于LB平板上，28 ℃活化培養(yǎng)24 h，重復(fù)活化3次，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 種子液制備

將活化后的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。

1.3.3 發(fā)酵液制備

將二級種子液以3%～5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.3.4 菌株生長曲線與發(fā)酵產(chǎn)酶酶活曲線測定

無菌條件下，對發(fā)酵液每隔4h定時取樣。28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)，利用分光光度計測定波長600 nm處吸光度值（OD600nm值），以確定菌株的生長情況和產(chǎn)甾醇酯酶活力的大小。

1.3.5 菌株粗酶液制備

對振蕩培養(yǎng)48h的發(fā)酵液，在溫度為4℃、轉(zhuǎn)速為8000r/min、時間為20 min條件下離心得到的上清，即為粗酶液[9]。

1.3.6 甾醇酯酶活性測定方法

酶活定義：在測定條件下，每分鐘催化1 μmol底物水解所消耗的酶量為一個酶活單位（IU）[9]。

根據(jù)甾醇酯酶活性的測定原理進(jìn)行酶活性測定，具體操作參考曾誠等[3]的報道：分別配制底物溶液（在0.15 mol/L磷酸緩沖液中先后加入膽固醇亞油酸酯0.61 mmol/L，異丙醇8.0%，0.015 TritonX-100 mol/L，調(diào)節(jié)pH為7.0）與4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮-苯酚工作液（0.15 mol/L磷酸緩沖液中分別加入1.48 mmol/L 4-乙酰氧基氮雜環(huán)丁酮，3.0 IU/mL過氧化物酶，0.5 IU/mL COD，0.01 mmol/L苯酚，pH 7.0），將兩者按照1∶2的比例混合，再加入適量酶液，充分混合后于37 ℃水浴條件下反應(yīng)15 min，以滅活酶液作為對照，測量波長500 nm處的紫外吸光度值，平行3次，取平均值。相對酶活（%）即為樣品酶活與同組最高酶活之比。

1.3.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件為28 ℃、200 r/min、搖瓶發(fā)酵48 h，碳源、氮源添加量為3.0%的基礎(chǔ)上，分別改變不同的發(fā)酵條件，考察不同碳源種類（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糊精）、最適碳源添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、不同氮源種類（尿素、牛肉膏、NH4Cl、酵母粉、NH4NO3、蛋白胨）、最適氮源添加量（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%）、不同無機(jī)鹽（1.0%KH2PO4、1.0%MgSO4·7H2O、1.0%（NH4）2SO4），不同的初始pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、培養(yǎng)溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、轉(zhuǎn)速（150 r/min、160 r/min、170 r/min、180 r/min、190 r/min、200 r/min）、裝液量（30 mL/250 mL、50 mL/250 mL、70mL/250mL、90mL/250mL、110mL/250mL、130mL/250mL）、二級種子液接種量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）對菌株Q-06生長的影響。

1.3.8 發(fā)酵條件Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計

在確定了菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)單因素條件后，在此基礎(chǔ)上，在發(fā)酵產(chǎn)酶條件中選擇酵母粉添加量、葡萄糖、轉(zhuǎn)速、磷酸二氫鉀、pH、接種量、裝液量和溫度8個因素作為PB試驗(yàn)的考察對象，進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計（N=12），最終確定3個顯著影響因素[10-11]。PB試驗(yàn)設(shè)計見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化PB試驗(yàn)設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of PB tests for fermentation conditions optimization

續(xù)表

1.3.9 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計

通過上述PB試驗(yàn)后，得到影響菌株Q-06發(fā)酵產(chǎn)酶的3個顯著因素，然后對其進(jìn)行步長設(shè)計，設(shè)計2個因素逐漸增大步長，1個因素逐漸減小步長，進(jìn)行中心組合試驗(yàn)[12]。

1.3.10 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

以菌株Q-06發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活性最高點(diǎn)為中心點(diǎn)，對上述最顯著的3因素進(jìn)行3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計。試驗(yàn)因素與水平見表2。運(yùn)用上述軟件所得到的最優(yōu)結(jié)果對預(yù)測值進(jìn)行驗(yàn)證，取3次試驗(yàn)均值[13]。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.11 數(shù)據(jù)處理與分析

通過Design-Expert.8.0.5b 軟件對中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長及發(fā)酵產(chǎn)酶酶活曲線

圖1 菌株Q-06生長曲線與發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig. 1 Growth curve and enzyme production curve of strain Q-06

由圖1生長曲線可發(fā)現(xiàn)，甾醇酯酶菌株Q-06以4 h作為分界線，4 h前為遲滯期；從4 h后菌株生長迅速，開始進(jìn)入對數(shù)生長期，該時期的菌株活力最旺盛，生長速率常數(shù)R最大代時最短；35 h后菌株開始進(jìn)入穩(wěn)定期，該階段菌株生長速率常數(shù)R=0，個數(shù)基本保持不變；60 h后菌株開始進(jìn)入衰亡期，該時期菌株總數(shù)減少。從圖1產(chǎn)酶曲線中還可看出，在4～20 h之間菌株Q-06發(fā)酵酶活較低，20～48 h酶活迅速增加，當(dāng)發(fā)酵時間為50 h時，達(dá)到酶活性最高點(diǎn)，而后酶活性緩慢下降，因此可判斷該菌株屬于同型發(fā)酵。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 不同種類的碳源及添加量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

碳源種類的差異對菌株產(chǎn)酶效果影響較大。由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源時，酶活力最高；以糊精為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源時，產(chǎn)酶活力最低，因此選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。

圖2 不同類型的碳源對酶活的影響Fig. 2 Effect of different carbon sources on enzyme activity

確定葡萄糖為菌株Q-06發(fā)酵產(chǎn)甾醇酯酶的最適宜碳源后，改變其添加水平，選出葡萄糖最適添加量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著葡萄糖添加量的增加，菌株產(chǎn)甾醇酯酶的能力先升高后降低，當(dāng)葡萄糖添加量為3%時，菌株產(chǎn)甾醇酯酶效果最好；因此，選擇葡萄糖3%為發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源添加量。

圖3 葡萄糖添加量對酶活的影響Fig. 3 Effect of glucose addition on enzyme activity

2.2.2 不同種類的氮源及添加量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

為確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)氮源種類，分別選擇不同種類的有機(jī)氮源和無機(jī)氮源添加于發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)果見圖4。

圖4 不同種類氮源對酶活的影響Fig. 4 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基以酵母粉為氮源時，發(fā)酵產(chǎn)酶活力最高，其次是尿素和牛肉膏。因此，選擇發(fā)酵產(chǎn)酶能力最高的酵母粉為最優(yōu)氮源。

在確定酵母粉為菌株發(fā)酵產(chǎn)甾醇酯酶的最適宜氮源后，改變其添加量，選出適合發(fā)酵的最適氮源添加量，結(jié)果見圖5。

圖5 酵母粉添加量對酶活的影響Fig. 5 Effect of yeast powder addition on enzyme activity

由圖5可知，隨著酵母粉含量在0.50%～1.25%范圍內(nèi)的增加，甾醇酯酶相對酶活不斷升高，當(dāng)酵母粉添加量為1.25%，酶活最高，因此選擇1.25%酵母粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基中最適氮源添加量。

2.2.3 不同種類無機(jī)鹽及添加量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖6、7可知，無機(jī)鹽（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4對發(fā)酵產(chǎn)酶均有一定的影響。當(dāng)加入量為0.4%時加入KH2PO4的發(fā)酵液內(nèi)相對活性最高。選出KH2PO4為最優(yōu)無機(jī)鹽，然后調(diào)整KH2PO4添加量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，考察不同濃度KH2PO4對酶活的影響，結(jié)果表明，無機(jī)鹽KH2PO4最適添加量為0.4%。

圖6 不同種類無機(jī)鹽對酶活的影響Fig. 6 Effect of different inorganic salts on enzyme activity

圖7 不同KH2PO4添加量對酶活的影響Fig. 7 Effect of different addition of KH2PO4 on enzyme activity

2.2.4 初始pH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

適當(dāng)?shù)膒H對菌株生長很重要，而且在生成產(chǎn)物時也需要適當(dāng)?shù)膒H。由圖8可知，當(dāng)初始pH為7.5時，酶活最高；當(dāng)初始pH為7.5～8.5時，仍存在80%以上的相對酶活，說明該菌株耐堿性較強(qiáng)；當(dāng)pH＜7.5時，產(chǎn)酶活力直線下降。初始pH為7.5時相對酶活最高，故最適發(fā)酵pH為7.5。

圖8 初始pH值對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig. 8 Effect of initial pH value on enzyme production by fermentation

2.2.5 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖9可知，隨著溫度的升高，酶活先不斷提高，當(dāng)溫度達(dá)到28℃時酶的活性達(dá)到最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時酶的活性出現(xiàn)下降趨勢。這一結(jié)果說明了該菌株具備低溫酶的特點(diǎn)，可以在工業(yè)生產(chǎn)中節(jié)約更多的能量，最適培養(yǎng)溫度為28 ℃。

圖9 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig. 9 Effect of culture temperature on enzyme production by fermentation

2.2.6 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵過程中，不同的轉(zhuǎn)速也會影響菌株產(chǎn)酶，原因是轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)著發(fā)酵過程的溶氧量，溶氧量的過高或過低直接影響菌株生長及后期酶的合成。由圖10可知，轉(zhuǎn)速＜180 r/min時隨著轉(zhuǎn)速的加快相對酶活也不斷提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速提高到180 r/min以上對菌株產(chǎn)酶造成不良影響，導(dǎo)致相對酶活開始下降，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時其相對酶活最高，故最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖10 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig. 10 Effect of rotation speed on enzyme production by fermentation

2.2.7 裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖11 裝液量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig. 11 Effect of loading volume on enzyme production by fermentation

在一定程度上，搖瓶的裝液量對酶活影響較大。過少的裝液量不利于后期的中試生產(chǎn)的量產(chǎn)，降低企業(yè)的生產(chǎn)效率。由圖11可知，當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時，發(fā)酵產(chǎn)酶活力最高，在裝液量超過50mL/250 mL時，酶的活性開始下降，不利于發(fā)酵產(chǎn)酶，故最佳裝液量為50 mL/250 mL。

2.2.10 接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖12 接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig. 12 Effect of inoculum on enzyme production by fermentation

由圖12可知，在接種量從2%提高到4%，相對酶活迅速提高，當(dāng)以4%～6%的接種量進(jìn)行接種時，相對酶活力均高于90%，在接種量高于5%時發(fā)酵過程中菌密度過大菌株生長受抑制產(chǎn)酶量降低，當(dāng)接種量為4%時，相對酶活最高。

2.3 Plackett-Burman設(shè)計篩選顯著因子

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果與顯著性分析分別見表3和表4。由表4可知，葡萄糖、裝液量、溫度的P值均小于0.05，達(dá)到顯著水平，即影響值均大于95%，對試驗(yàn)結(jié)果影響最顯著。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman tests design

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計顯著性分析Table 4 Significance analysis of Plackett-Burman tests design

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

在完成PB試驗(yàn)設(shè)計后，將葡萄糖和溫度的值按照步長依次減小，裝液量的值按照步長逐步增大，設(shè)計最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)果見表5。由表5可知，當(dāng)葡萄糖添加量為3.5%，溫度為28 ℃，裝液量為80 mL/250 mL時，微生物產(chǎn)甾醇酯酶活性最大。所以選擇以第2組實(shí)驗(yàn)作為中心組合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent tests

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

通過PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)確定的3個顯著因素葡萄糖、裝液量和溫度后，再運(yùn)用Design-Expert.V8.0.5b軟件，設(shè)計3因素3水平的BB試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Benhnken試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of Box-Benhnken tests for fermentation conditions optimization

續(xù)表

通過Design-Expert.8.0.5b 軟件對中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（見表7）和方差分析（見表8）。由此可以得到，菌株Q-06產(chǎn)甾醇酯酶酶活（Y）與影響發(fā)酵顯著因素之間的回歸方程如下：

表7 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 7 Significance test of regression coefficients

表8 回歸方程的方差分析Table 8 Variance analysis of regression equation

由表7和表8可知，該設(shè)計中失擬項(xiàng)P＞0.05，不存在失擬因素，因此，該模型有意義[14]。在回歸模型中，決定系數(shù)R2為99.37%，校正決定系數(shù)R2Adj為0.973 2，模型變異系數(shù)僅為2.68%。由此可以看出，該模型的擬合度較好，設(shè)計可靠。因此，可以使用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)分析和預(yù)測菌株實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果。

統(tǒng)計軟件Design-Expert.V8.0.6對回歸方程進(jìn)行分析，得響應(yīng)面及等高線見圖13，通過對回歸方程進(jìn)行分析，得到最佳工藝條件為，并根據(jù)實(shí)際操作條件調(diào)整為發(fā)酵溫度28 ℃、葡萄糖添加量3.0%、裝液量50 mL/250 mL，由優(yōu)化前的360.00 U/L提高至479.64 U/L，是優(yōu)化前的1.33倍。

圖13 葡萄糖添加量、裝液量及溫度間交互作用對酶活性的影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 13 Response surfaces plots and contour lines of effects of interaction between glucose addition, loading volume and temperature on enzyme activity

3 結(jié)論

為了提高莓實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）Q-06產(chǎn)低溫膽固醇酯酶的能力，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過PB試驗(yàn)設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，對菌株Q-06發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，培養(yǎng)基配方中葡萄糖添加量3.0%，酵母粉添加量為1.3%，（NH4）2SO4添加量0.010%，MgSO4·7H2O添加量0.050%，KH2PO4添加量0.400%。最適宜發(fā)酵溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，接種量4%，初始pH 7.5，裝液量50 mL/250 mL。研究通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化了發(fā)酵菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，發(fā)酵菌株Q-06產(chǎn)甾醇酯酶由優(yōu)化前的360.00 U/L提高至479.64 U/L，是優(yōu)化前的1.33倍。達(dá)到了優(yōu)化目的，并為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。