熊香元，歐陽(yáng)雅琦，張立釗，陳力力*，周 玥，龔慧可

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.食品科學(xué)和生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128）

鮮濕發(fā)酵米粉是我國(guó)南方地區(qū)特色美食之一，口感爽滑、味道鮮美且食用便捷，深受消費(fèi)者喜愛[1]。鮮濕發(fā)酵米粉經(jīng)大米浸泡（發(fā)酵）、清洗、磨漿、熟化、成型、蒸粉、冷卻、包裝等工序制成[2]。中國(guó)南方常用“續(xù)渣法”發(fā)酵米粉，即將前次發(fā)酵液按適量比例接種至新鮮原料中，這種發(fā)酵方式能促進(jìn)發(fā)酵，減少發(fā)酵時(shí)間[3]。發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生酸和酶等代謝產(chǎn)物改變大米化學(xué)成分，提高米粉蒸煮和食用品質(zhì)。目前，已有學(xué)者對(duì)發(fā)酵米粉中微生物菌群組成進(jìn)行了相關(guān)研究，然而不同地區(qū)樣品研究結(jié)果不盡相同。LU Z H等[4]分離純化發(fā)酵米粉中的微生物，發(fā)現(xiàn)米粉發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸桿菌（Lactobacillus）、乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）、酵母菌；馬霞[5]從大米發(fā)酵液中分離得到1株優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析鑒定其為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。傳統(tǒng)自然發(fā)酵米粉的發(fā)酵過程主要由自然環(huán)境和“續(xù)渣液”中微生物發(fā)酵完成，微生物種群的復(fù)雜和不確定性造成發(fā)酵時(shí)間隨季節(jié)變化較大，企業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)能效率受限，經(jīng)濟(jì)效益下降，發(fā)酵米粉規(guī)范管理和生產(chǎn)過程標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程緩慢。因此，無論是出于發(fā)酵條件優(yōu)化，還是食品安全控制方面考慮，了解大米生產(chǎn)過程中發(fā)酵液菌相變化顯得十分重要。

在發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中，發(fā)酵微生物（優(yōu)勢(shì)菌）數(shù)量變化是決定發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，傳統(tǒng)微生物菌落平板計(jì)數(shù)法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且滯后，起不到預(yù)測(cè)作用[6]，而預(yù)測(cè)微生物學(xué)能有效規(guī)避這些缺點(diǎn)。預(yù)測(cè)微生物學(xué)是一門交叉性學(xué)科，包含了數(shù)學(xué)、化學(xué)、微生物學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)等內(nèi)容，將微生物數(shù)量變化趨勢(shì)通過數(shù)學(xué)方法表達(dá)出來，不僅能預(yù)測(cè)發(fā)酵食品中優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)規(guī)律，還能監(jiān)測(cè)有害菌的生長(zhǎng)變化，保證食品的發(fā)酵周期和安全性[7]，從而為其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。預(yù)測(cè)微生物學(xué)常采用Exponential-linear模型、Logistic模型、Gompertz模型等基礎(chǔ)數(shù)學(xué)模型，其中Gompertz模型能較好的預(yù)測(cè)微生物的生長(zhǎng)趨勢(shì)，Gompertz曲線呈S型，其形態(tài)特征是前后兩段緩慢增長(zhǎng)期中間夾著一段快速增長(zhǎng)期，最具有代表性[8]；修正的Gompertz模型可以描述一定環(huán)境下微生物數(shù)量隨時(shí)間變化的關(guān)系[9]。目前，國(guó)內(nèi)外利用Gompertz模型對(duì)食品基質(zhì)中微生物生長(zhǎng)模型的建立已有相關(guān)報(bào)道。劉亞兵等[10]運(yùn)用Gompertz模型在冷卻牛肉中建立了假單胞菌生長(zhǎng)模型，有效地預(yù)測(cè)了冷卻牛肉的貨架期；LEE Y J等[11]運(yùn)用Gompertz模型擬合了豬肉中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線。Gompertz模型常應(yīng)用于預(yù)測(cè)食品貨架期[12]，而應(yīng)用于預(yù)測(cè)米粉發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)趨勢(shì)的報(bào)道較少。

本研究基于鮮濕發(fā)酵米粉生產(chǎn)工藝，探究不同發(fā)酵時(shí)期大米發(fā)酵液中微生物種類及其數(shù)量變化規(guī)律，并運(yùn)用修正的Gompertz模型[13]，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件擬合微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，為進(jìn)一步研究鮮濕發(fā)酵米粉生產(chǎn)過程中優(yōu)勢(shì)菌及其作用，提高生產(chǎn)效率，控制發(fā)酵周期，推進(jìn)鮮濕發(fā)酵米粉標(biāo)準(zhǔn)制定奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

以湖南鮮濕米粉生產(chǎn)廠自然發(fā)酵大米發(fā)酵液作為試驗(yàn)材料，采集發(fā)酵0～4 d大米發(fā)酵液樣品5組各3份，分別裝入無菌采樣瓶中，并編號(hào)0d1、0d2、0d3、1d1、1d2、1d3、2d1、2d2、2d3、3d1、3d2、3d3、4d1、4d2、4d3，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于冰箱保存，20 h內(nèi)檢測(cè)處理。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）培養(yǎng)基：北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250BⅢ恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FE28-pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；CX23LEDRFS1C-生物顯微鏡：日本奧林巴斯工業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大米發(fā)酵液可培養(yǎng)微生物分離和計(jì)數(shù)

將發(fā)酵液樣品按10倍梯度稀釋后，取適當(dāng)濃度的樣品懸液，根據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[14]、GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[15]、GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[16]、GB 4789.41—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)c桿菌科檢驗(yàn)》[17]、葡萄球菌和微球菌的方法[18]分別對(duì)菌落總數(shù)、乳酸菌、霉菌酵母菌、腸桿菌和球菌進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。

1.3.2 典型微生物形態(tài)特征觀察

觀察各培養(yǎng)基平板中微生物的菌落大小、顏色、形態(tài)、質(zhì)地、光澤、隆起度、透明度和邊緣結(jié)構(gòu)等菌落形態(tài)，并對(duì)典型的細(xì)菌菌落和真菌菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色和美藍(lán)染色[19]，于光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)和排列方式等菌體形態(tài)特征。

1.3.3 不同時(shí)期大米發(fā)酵液pH值的測(cè)定

采用pH計(jì)分別測(cè)定發(fā)酵0 d、1 d、2 d、3 d、4 d的大米發(fā)酵液的pH值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.4 微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型擬合[13]

采用Origin 9.0和SPSS25.0對(duì)可培養(yǎng)微生物試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)修正的Gompertz模型擬合微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，利用一級(jí)模型描述發(fā)酵時(shí)間與生物量的關(guān)系。修正的Gompertz模型如下：

式中：t為發(fā)酵時(shí)間，d；Nt為微生物在發(fā)酵時(shí)間t時(shí)的菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值，lg（CFU/mL）；A為初始菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值，lg（CFU/mL）；C為隨發(fā)酵時(shí)間無限增加時(shí)微生物增量的對(duì)數(shù)值，lg（CFU/mL）；B為在發(fā)酵時(shí)間M時(shí)的相對(duì)最大比生長(zhǎng)速率，d-1；M為達(dá)到相對(duì)最大比生長(zhǎng)速率的所需時(shí)間，d。

其方程式是雙指數(shù)函數(shù)，是一個(gè)非線性的微生物生長(zhǎng)模型。根據(jù)該函數(shù)參數(shù)與微生物參數(shù)互換后可得出微生物生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率v（d-1）、微生物生長(zhǎng)遲滯期（lag-phase duration，LPD）（d）和微生物生長(zhǎng)穩(wěn)定期菌落總數(shù)的最大對(duì)數(shù)值Nmax（lg（CFU/mL）），其換算公式如下：

v=BC/e（e=2.7182）；LPD=M-（1/B）；Nmax=A+C。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)微生物形態(tài)特征

從選擇性培養(yǎng)基中挑取典型菌落進(jìn)行編號(hào)，觀察菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征。在MRS培養(yǎng)基上共挑取了3種不同特征的菌落，分別編號(hào)為R1、R2、R3；在孟加拉紅培養(yǎng)基上挑取類似霉菌和酵母的典型菌落，分別編號(hào)為M1、M2、J1；在腸球菌培養(yǎng)基上挑取典型菌落，分別編號(hào)為Q1、Q2；部分菌株的菌落大小、顏色、形態(tài)、質(zhì)地、光澤、隆起度、透明度和邊緣結(jié)構(gòu)等和顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)和排列方式見圖1，具體描述見表1。

圖1 部分典型菌落的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig. 1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of partial typical colonies

由圖1及表1可知，大米發(fā)酵液中微生物種類豐富，細(xì)菌主要為革蘭氏陽(yáng)性無芽孢菌，酵母菌形態(tài)單一，均呈圓形。米粉發(fā)酵過程中存在的乳酸菌可能為乳球菌和乳桿菌，這與前人報(bào)道一致[20]；乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸和酶具有消化淀粉、糖、蛋白質(zhì)或脂肪的能力，對(duì)大米淀粉純化提升米粉品質(zhì)有著積極作用。LI N等[21]研究表明，乳酸菌發(fā)酵大米中蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等含量發(fā)生變化，米粉彈性增強(qiáng)、吐漿率降低，口感柔韌順滑。

表1 不同選擇性培養(yǎng)基典型菌落的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征Table 1 Colony and cell morphological characteristics of typical colonies in different selective media

2.2 可培養(yǎng)微生物數(shù)量及變化規(guī)律

米粉發(fā)酵過程中大米發(fā)酵液微生物數(shù)量及變化規(guī)律見表2。

表2 大米發(fā)酵液微生物數(shù)量及其變化規(guī)律Table 2 Quantity and change rule of microorganisms in rice fermentation broth

由表2可知，大米發(fā)酵液中菌落總數(shù)和真菌菌數(shù)變化趨勢(shì)相似，呈先上升后下降或發(fā)酵后期趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。發(fā)酵0 d時(shí)菌落總數(shù)最大，乳酸菌次之，分別為2.79×107CFU/mL、2.50×106CFU/mL。發(fā)酵前期原料、環(huán)境和操作人員等因素造成菌落總數(shù)最高；發(fā)酵前加入的8%“續(xù)渣液”中主要菌群可能為乳酸菌，使得發(fā)酵0 d時(shí)乳酸菌菌落數(shù)較大。發(fā)酵1 d后各種微生物適應(yīng)環(huán)境，菌落總數(shù)、乳酸菌菌數(shù)、霉菌酵母菌數(shù)均增加一個(gè)數(shù)量級(jí)；霉菌酵母培養(yǎng)基上霉菌數(shù)量較少，以酵母菌為主。從菌落平板計(jì)數(shù)結(jié)果來看，大米發(fā)酵液中乳酸菌和酵母菌數(shù)量最多，是大米發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌。乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸能與酵母菌產(chǎn)生的酒精結(jié)合成乙酸乙酯，賦予米粉良好的香氣[22]。發(fā)酵0～1 d，乳酸菌快速增長(zhǎng)，此時(shí)乳酸菌適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，誘導(dǎo)酶和有關(guān)中間代謝產(chǎn)物都已完全合成，酵母菌所產(chǎn)生的氨基酸和維生素能為乳酸菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[23]。發(fā)酵2 d后乳酸菌數(shù)量增多，菌落總數(shù)增長(zhǎng)趨于平緩，真菌、腸球菌數(shù)量減少。發(fā)酵2～4 d，乳酸菌增長(zhǎng)速率相對(duì)放緩，這可能是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸菌作為發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌增長(zhǎng)迅猛，與其他菌群爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在這種競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境下酵母菌數(shù)量逐漸減少，假絲酵母、釀酒酵母等酵母菌含有許多酶類如糖化酶、淀粉酶等，能將淀粉轉(zhuǎn)化為單糖直接為乳酸菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24]。酵母菌數(shù)量下降使乳酸菌可直接利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少和代謝產(chǎn)物積累出現(xiàn)反饋抑制作用導(dǎo)致乳酸菌增長(zhǎng)速率緩慢。

可培養(yǎng)微生物數(shù)量不僅與發(fā)酵時(shí)間有關(guān)，同時(shí)受環(huán)境pH值影響。由表2亦可知，菌落總數(shù)發(fā)酵前期增長(zhǎng)速率大于發(fā)酵中后期，發(fā)酵前期發(fā)酵液處于中性環(huán)境適合各類微生物生長(zhǎng)，菌落總數(shù)快速增加；發(fā)酵后期菌落總數(shù)增長(zhǎng)速率不如乳酸菌，一方面是因?yàn)殡S著乳酸菌數(shù)量的急劇增加，發(fā)酵液中有機(jī)酸含量大量積累，低pH值環(huán)境不適合于大多數(shù)微生物生長(zhǎng)，其他微生物生長(zhǎng)緩慢或受到抑制；另一方面乳酸菌代謝產(chǎn)生的抗菌肽，如細(xì)菌素，具有良好的抑菌作用[25]。發(fā)酵1 d后發(fā)酵液pH值迅速降低，pH值下降3.26，隨后發(fā)酵液pH值變化不大，這與張玉榮等[26]報(bào)道一致。這可能是因?yàn)槿樗峋罅糠敝呈拱l(fā)酵罐成為高密度環(huán)境，此時(shí)乳酸菌代謝產(chǎn)物積累和反饋抑制作用，乳酸菌產(chǎn)酸量達(dá)到峰值，發(fā)酵液中pH值不再發(fā)生大幅度變化[27]。前人報(bào)道酵母菌主要提高米粉的風(fēng)味，乳酸菌提高米粉的食用品質(zhì)[28]，因而控制發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵環(huán)境中乳酸菌和酵母菌比例對(duì)發(fā)酵米粉品質(zhì)有著重要作用。

2.3 菌落總數(shù)及乳酸菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型擬合

采用Gompertz模型，運(yùn)用Origin9.0繪圖軟件對(duì)大米發(fā)酵液中的菌落總數(shù)及乳酸菌隨時(shí)間變化情況進(jìn)行擬合。利用Gompertz模型擬合菌落總數(shù)及乳酸菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)曲線見圖2，菌落總數(shù)及乳酸菌數(shù)生長(zhǎng)預(yù)測(cè)曲線所對(duì)應(yīng)的數(shù)學(xué)方程和模型參數(shù)分別見表3、表4。

Gompertz一級(jí)模型是專門用來描述微生物生長(zhǎng)的函數(shù)，模型的決定系數(shù)R2描述了實(shí)驗(yàn)擬合參數(shù)的相關(guān)性，系數(shù)越接近1表示擬合度越高，參數(shù)之間的相關(guān)性越好[29]。由表3可知，菌落總數(shù)和乳酸菌總數(shù)的擬合度判定系數(shù)R2分別為0.953 5和0.999 2，擬合度判定系數(shù)R2值較高，均＞0.95，說明Gompertz模型能很好的描述菌落總數(shù)和乳酸菌的生長(zhǎng)曲線，以此生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)曲線為依據(jù)，可預(yù)測(cè)米粉生產(chǎn)過程中發(fā)酵液中菌落總數(shù)和乳酸菌的數(shù)量。方程擬合的初始菌落總數(shù)及乳酸菌數(shù)的對(duì)數(shù)值分別為7.51、6.43，最大菌落總數(shù)及乳酸菌數(shù)在第4天，分別為8.40、8.41，且由方程可以判斷出發(fā)酵3 d時(shí)發(fā)酵液中菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)量相當(dāng)。

圖2 菌落總數(shù)（a）及乳酸菌（b）生長(zhǎng)曲線擬合Fig. 2 Growth curve fitting of total bacterial count (a) and lactic acid bacteria (b)

表3 菌落總數(shù)和乳酸菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程Table 3 Growth kinetics equations of total bacterial count and lactic acid bacteria

表4 菌落總數(shù)和乳酸菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Growth kinetic parameters of total bacterial count and lactic acid bacteria

由表4可知，乳酸菌的LPD值較菌落總數(shù)大，說明米粉發(fā)酵液中乳酸菌的延滯期較菌落總數(shù)長(zhǎng)，這可能是由于發(fā)酵初期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，發(fā)酵液環(huán)境適宜，其他細(xì)菌迅速繁殖。乳酸菌的v值和M值均大于菌落總數(shù)，這說明乳酸菌最大比生長(zhǎng)速率大于菌落總數(shù)，而達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率時(shí)間較菌落總數(shù)稍晚，但兩者B值相差不大，說明在到達(dá)最大比生長(zhǎng)速率時(shí)的相對(duì)最大比生長(zhǎng)速率相差不大。發(fā)酵時(shí)間對(duì)米粉品質(zhì)有重要作用，發(fā)酵時(shí)間過短，乳酸菌和酵母菌等微生物菌體濃度不夠，對(duì)大米中碳水化合物發(fā)酵能力不強(qiáng)，米粉品質(zhì)達(dá)不到要求；而長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵的大米有酸味和腐敗臭味，影響米粉品質(zhì)[30]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以不同發(fā)酵時(shí)間大米發(fā)酵液為研究對(duì)象，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)期發(fā)酵液中微生物菌落數(shù)量，并利用修正的Gompertz模型對(duì)菌落總數(shù)和乳酸菌總數(shù)進(jìn)行一級(jí)擬合。平板計(jì)數(shù)結(jié)果表明，米粉生產(chǎn)過程中大米粉發(fā)酵液中數(shù)量最高的微生物為乳酸菌和酵母菌，修正的Gompertz模型對(duì)菌落總數(shù)和乳酸菌總數(shù)具有較高的擬合度，判定系數(shù)R2均＞0.95。經(jīng)擬合得出，菌落總數(shù)和乳酸菌總數(shù)的最大比生長(zhǎng)速率分別為0.657 d-1、1.418 d-1，延滯期（LPD）分別為0.023 d、0.224 d，穩(wěn)定期最大菌落數(shù)對(duì)數(shù)值分別為8.40、8.41。利用該模型可預(yù)測(cè)發(fā)酵液在不同發(fā)酵時(shí)間的乳酸菌及菌落總數(shù)變化趨勢(shì)，這對(duì)不同階段發(fā)酵液環(huán)境條件控制、米粉質(zhì)量監(jiān)控及保鮮儲(chǔ)存等都有非常重要的意義。