楊雪，林錕，譚麗菊，王江濤*

( 1. 中國海洋大學 海洋化學理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

1 引言

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高密度、集約化的發(fā)展，大量的污水被排入海中，造成海洋生態(tài)平衡遭到嚴重破壞，有害藻華現(xiàn)象頻發(fā)[1]。自2007 年以來，黃海海域連續(xù)暴發(fā)由大型綠藻滸苔（Ulva prolifera）造成的綠潮災害，呈現(xiàn)連續(xù)性和常態(tài)化趨勢。在黃海綠潮期間，大量的滸苔覆蓋在海水表面遮蔽陽光，使得一部分海洋生物無法正常光合作用[2]，滸苔還會分泌出有毒的化學物質(zhì)，造成其他生物的死亡，對于近海的海洋生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴重破壞，給我國沿海城市的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、旅游業(yè)、居民生活等帶來了諸多負面影響，嚴重威脅地區(qū)的可持續(xù)發(fā)展[3-7]。

大型海藻種類較多，按色素種類及含量不同可分為紅藻、綠藻、褐藻等，廣泛分布于潮間帶及潮間帶下的透光層，固著生長于淺海海底的巖礁上或漂浮生長。本研究兩個目標藻種，滸苔呈中空管狀體結(jié)構(gòu)，分枝細長，最長的分枝能夠達到1 m，生長于沿岸高、中潮帶沙礫中，主要分布在日本群島及黃海地區(qū)[8-9]；石莼（Ulva lactuca）是一種比較常見的海藻類植物，生長于低潮帶，其主要生活在黃海和渤海的沿岸地區(qū)[10-11]。對限制性營養(yǎng)鹽的競爭能力是藻類大量繁殖的關(guān)鍵，Redfield[12]提出浮游植物吸收海水中營養(yǎng)鹽濃度的比值為Si∶N∶P = 16∶16∶1，適宜的氮磷比值有利于浮游植物的生長繁殖，反之會造成營養(yǎng)結(jié)構(gòu)失調(diào)，浮游生物種群結(jié)構(gòu)的改變，甚至引發(fā)藻華災害。大量研究證實，黃海綠潮災害的頻發(fā)，與海水中豐富的營養(yǎng)鹽關(guān)系密切[13-14]。

在大型海藻生長過程中，需要大量營養(yǎng)鹽的支持，因此當大型海藻與其他浮游植物共存時，其對營養(yǎng)鹽的掠取使得其他浮游生物的競爭力下降。目前，國內(nèi)外學者圍繞滸苔與浮游微藻的競爭作用開展了一系列研究[15-16]，取得了一定的科學認知，但對于滸苔與其他大型藻類的競爭作用研究較少。大型藻類之間也不可避免存在著競爭作用，對營養(yǎng)鹽的吸收和適應性也存在著差異，導致了它們之間的競爭作用有強弱之分。已有研究結(jié)果表明，兩種常見綠潮藻石莼、滸苔在相同條件下培養(yǎng)時，石莼的相對生長速率都是最大的，并且生長速率顯著高于滸苔和其他大型藻類[17]，這與石莼的比表面積有關(guān)[18]。石莼作為黃海和渤海低潮帶的又一種常見海藻類植物，卻并沒有造成如滸苔類似的大規(guī)模暴發(fā)現(xiàn)象，探究其成因，南黃海海域N/P 比值水平更適合滸苔的生長繁殖，這可能是滸苔大規(guī)模暴發(fā)的一個重要原因[2]。因此，本文主要研究不同的氮磷比下滸苔和石莼共培養(yǎng)下的競爭作用，探索營養(yǎng)水平對滸苔生長的影響，以期為滸苔綠潮機制提供科學基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 現(xiàn)場調(diào)查

蘇北淺灘及其鄰近海域水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)達，海水富營養(yǎng)化較為嚴重，滸苔于3 月在蘇北淺灘海域開始萌發(fā)，并在風和海流的作用下，向北漂浮聚集，在我國山東半島海域形成綠潮災害，因此本研究于2018 年5 月12-24 日 對 蘇 北 淺 灘 及 其 鄰 近 海 域（32.3°～34.0°N，120.6°～122.2°E）進行了為期13 d 的調(diào)查，布設(shè)了6 個斷面24 個站位。由于蘇北淺灘及其鄰近海域水深較淺，故只采集表層海水，水樣采集后立即經(jīng)GF/F 濾膜（0.7 μm，Whatman，450℃灼燒4 h）過濾，樣品于?20℃冷凍保存，用于后續(xù)氮磷比值的分析。

2.2 實驗材料

實驗用滸苔及石莼于2018 年5 月采自蘇北淺灘海域，采集后用高溫高壓滅菌海水反復沖洗3～4 次，用軟毛刷刷去泥沙和附生生物，鏡檢確認無雜藻后，挑取生長狀態(tài)良好“無白化”的藻體備用。實驗用海水由專業(yè)人員采集自蘇北淺灘，用孔徑0.45 μm 的醋酸纖維濾膜過濾，經(jīng)過120℃高溫殺菌20 min，靜置冷卻至室溫后待用。海水鹽度為31，海水本底N 濃度為13.36 μmol/L，為0.24 μmol/L。

2.3 實驗設(shè)計

實驗設(shè)置3 組不同的氮磷比，分別為N/P =3.2∶1、N/P = 16∶1、N/P = 40∶1，濃度設(shè)計如表1 所示，除氮、磷外其余營養(yǎng)要素按f/2 培養(yǎng)基進行補充，實驗在添加有200 mL 培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中進行，培養(yǎng)期間每兩天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶均勻放置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為20℃，光照強度60 μmol/(m2·s)，光暗比為12 h∶12 h。實驗分為3 組培養(yǎng)體系，滸苔單獨培養(yǎng)，石莼單獨培養(yǎng)，滸苔與石莼混合培養(yǎng)，兩種藻類均為非附著生長，每組設(shè)置3 組重復，實驗共進行11 d。

表 1 培養(yǎng)液中氮、磷添加含量Table 1 Addition of nitrogen and phosphorus in culture solution

2.4 生物量及相對增長率的測定與計算

實驗采用測定濕重和分枝（直徑）長度的方法觀測各種營養(yǎng)條件下滸苔和石莼的生長速率。濕重法是將培養(yǎng)的所有滸苔（石莼）撈出，用吸水紙吸干藻體表面的水分，置于干燥的培養(yǎng)皿中于分析天平稱重，滸苔（石莼）初始重量均為（0.20 ± 0.01） g。測量滸苔平均分枝長度法，是用鑷子夾住一株滸苔的中心主枝部分，放入有滅菌海水的培養(yǎng)皿中，讓滸苔分枝向一邊自然伸展，用厘米尺測量其一端到最長分枝末端長度，即是這一株滸苔長度。測量這組燒杯中的所有滸苔分枝長度，計算其平均長度。測量石莼平均直徑法，是將石莼用打孔器切成直徑為1.5 cm 的大小相同的圓片，在各個條件下培養(yǎng)后測定其平均直徑。

2.5 營養(yǎng)鹽測定

使用營養(yǎng)鹽自動分析儀（BRAN LUEBBE，AA3）以分光光度法對采集水樣的營養(yǎng)鹽濃度進行分析，主要分析參數(shù)及方法為：總氮，堿性過硫酸鉀消解分光光度法；總磷，堿性過硫酸鉀消解鉬銻藍分光光度法。

2.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19 對滸苔及石莼生物量進行統(tǒng)計分析，比較不同培養(yǎng)體系間相對增長率的差異（單因素方差分析，one-way ANOVA），p＜ 0.05 作為顯著性差異的標準。

3 結(jié)果

3.1 滸苔暴發(fā)時蘇北淺灘海域氮磷比值

蘇北淺灘及其臨近海域表層水體氮磷比值的平面分布如圖1 所示。由圖可看出，蘇北淺灘及其臨近海域表層水體氮磷比值總體呈現(xiàn)近岸高，遠岸分布不均的分布特征，其中高值中心位于江蘇省鹽城市大豐區(qū)附近海域，可能由于該海域漁業(yè)養(yǎng)殖及浮游生物活動密集，排（釋）放大量氮。調(diào)查海區(qū)總氮濃度范圍在13.88～50.92 mg/L，平均值為28.65 mg/L；總磷濃度范圍在0.35～0.96 mg/L，平均值為0.58 mg/L；氮磷比在36.12～63.12 之間，平均值為48.42。水體中氮磷比值與浮游生物體中氮磷比值越接近越有利于浮游生物生長，溫珊珊等[19]測得滸苔藻體中N/P 為45.8，說明蘇北淺灘水體氮磷比值十分適宜滸苔的生長。根據(jù)氮磷比值確定整個海區(qū)在滸苔暴發(fā)期間存在磷限制，滸苔暴發(fā)期間根據(jù)體內(nèi)的氮磷比吸收大量的氮、磷，然而海區(qū)磷含量遠小于滸苔生長所消耗的量。

圖 1 本文采樣站位和蘇北淺灘海域氮磷比值（2018 年5 月）Fig. 1 The sampling stations and the ratio of nitrogen to phosphorus distribution in the Subei Shoal (May 2018)

3.2 不同氮磷比對滸苔生長影響

不同氮磷比條件下單獨培養(yǎng)滸苔的濕重及生長率、分枝長度及分枝增長率隨時間的變化情況如圖2所示。不同氮磷比值對滸苔的生長影響不同，N/P =3.2∶1、N/P = 16∶1、N/P = 40∶1 這3 組的日均相對增長速率（濕重）分別為1.86%、2.23%、3.81%。由圖2可以綜合看出，N/P = 40∶1 組相對于其他兩組對滸苔生長促進效果更明顯，說明在培養(yǎng)液中高氮磷比能促進滸苔的生長，氮對滸苔生長的促進效果更明顯。由于滸苔分枝長度較難控制統(tǒng)一，盡量選擇了分枝長度相近的滸苔，從滸苔分枝長度看（圖2c），N/P =3.2∶1 組的滸苔分枝長度基本沒有增長，相比之下N/P = 40∶1 組呈現(xiàn)出了很好的增長，在11 d 培養(yǎng)之后分枝長度增加了49.72%，說明滸苔生理狀態(tài)較好。從生長速率來看，N/P = 3.2∶1 組和N/P = 16∶1組實驗初期生長速率快，到后期開始降低甚至出現(xiàn)負增長，且滸苔藻體開始出現(xiàn)“白化”現(xiàn)象，考慮是由于部分營養(yǎng)元素逐漸被消耗不能滿足滸苔的生長需求，因而滸苔不再生長甚至死亡。

3.3 不同氮磷比對石莼生長影響

不同氮磷比條件下單獨培養(yǎng)石莼的濕重及生長率、直徑長度及直徑增長率隨時間的變化如圖3 所示。N/P = 3.2∶1、N/P = 16∶1、N/P = 40∶1 這3 組的日均相對增長速率（濕重）分別為7.48%、6.04%、5.25%。由圖可看出N/P = 3.2∶1 組的石莼生長情況優(yōu)于N/P = 16∶1 組和N/P = 40∶1 組。石莼在實驗初期生長速率快，然后逐漸平穩(wěn)生長，到后期仍有生長的趨勢，并不像滸苔呈現(xiàn)停止生長甚至死亡。從直徑長度也可以看出，在培養(yǎng)中期石莼直徑增長速率最快，可能是由于實驗初期石莼切片之后邊緣還未適應環(huán)境，短期內(nèi)增長速率未呈現(xiàn)快速增長，但直徑長度總體呈現(xiàn)一直增長的趨勢，N/P = 3.2∶1 組在培養(yǎng)11 d后增長了0.26 cm。有學者研究表明，石莼中含有IAA類生長素能夠增加細胞滲透吸收能力，從而使細胞體積增大，還能促進RNA 和蛋白質(zhì)的合成，為合成原生質(zhì)體和細胞壁提供原材料，保持石莼的持久生長[20]。

3.4 不同氮磷比對共培養(yǎng)下滸苔和石莼影響

如圖4 所示，在共培養(yǎng)下，高氮磷比N/P = 40∶1組滸苔在實驗初期有明顯增長趨勢，但在實驗后期出現(xiàn)下降，可能是由于滸苔對于磷的吸收利用能力不如石莼，因此出現(xiàn)了磷的限制作用；N/P = 16∶1 組滸苔的生長情況并不明顯，培養(yǎng)5 d 后生物量便出現(xiàn)下降的趨勢；而N/P = 3.2∶1 組的滸苔在培養(yǎng)3 d 后生物量呈現(xiàn)急劇下降，生長速率甚至低至?7.12%，說明滸苔生長受到了極大限制。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，N/P =3.2∶1 組和N/P = 16∶1 組滸苔藻體“白化”現(xiàn)象明顯，說明部分滸苔受到營養(yǎng)限制。在實驗后期，將從培養(yǎng)瓶上刮下綠色附著物制片后進行鏡檢觀察，顯示為滸苔孢子，說明滸苔釋放出孢子以加速繁殖，當孢子釋放后滸苔死亡[21]。相比而言，石莼在N/P = 3.2∶1 組、N/P = 16∶1 組、N/P = 40∶1 組的生物量都有明顯增加，由表2、圖4 也可以看出在共培養(yǎng)條件下，石莼的相對生長速率均比滸苔大。綜上可得，滸苔和石莼共培養(yǎng)時，滸苔的生長情況均不如單獨培養(yǎng)，并且氮磷比越小越不利于滸苔的生長，而石莼的生長情況相差不是很大，說明石莼吸收營養(yǎng)鹽的能力強于滸苔，尤其是吸收磷的能力，這可能與石莼的細胞結(jié)構(gòu)以及比表面積有關(guān)。

圖 2 不同N/P 條件下單獨培養(yǎng)滸苔的濕重（a、b）及分枝長度（c、d）變化Fig. 2 Changes in wet weight (a, b) and branch length (c, d) of U. prolifera under different N/P conditions of pure culture

4 討論

有國外學者提出當海洋中的N/P ＞ 22 時，藻類的生長會相對受磷的限制；N/P ＜ 10 時，藻類生長受氮的影響比較大；當22 ＞ N/P ＞ 10 時，不同的藻類受氮、磷影響不同[22]。在本研究中，共培養(yǎng)時，N/P =40∶1 組滸苔在培養(yǎng)前期狀態(tài)較好，到后期開始出現(xiàn)生物量降低的趨勢，可能是由于競爭作用導致磷的限制而造成的；N/P = 3.2∶1 組滸苔的生長情況較差，相對生長速率甚至為負值，說明滸苔的生長受到了極大的限制甚至死亡，證實了在一定范圍內(nèi)氮是影響滸苔生長的主要因子。吳婷[13]研究發(fā)現(xiàn)海水中添加磷對滸苔的生長具有一定的促進作用，但當添加的磷達一定濃度時，促進作用不如氮明顯，相對于氮，滸苔受磷添加影響較弱。龐秋婷等[23]關(guān)于滸苔現(xiàn)場圍隔實驗的結(jié)果也顯示，在磷酸鹽含量適中的培養(yǎng)條件下，高濃度氮更能促進滸苔的生長，與本文研究一致。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)時滸苔競爭力不如石莼，目前對于滸苔暴發(fā)機制已有大量研究，主要是從滸苔漂浮氣囊結(jié)構(gòu)及其對光照和溫度的適應性等方面進行分析[16,24]，本研究從氮磷比值角度進行綜合分析。氮磷比較大的N/P = 40∶1 組滸苔長勢明顯比其他兩組要好，相反，增加磷濃度對石莼的生長有一定促進作用，其適應較低的N/P，與表3 中他人研究結(jié)果一致。綜合年際調(diào)查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，2010 年以前，黃海海域N/P 比值呈現(xiàn)逐年上升趨勢，到2010 年上升至最大值110，在2010 年后開始出現(xiàn)急劇下降，可能與自2007 年以來出現(xiàn)的滸苔綠潮有關(guān)，滸苔對于氮的偏好可能是造成比值出現(xiàn)下降的原因[32]。在本研究調(diào)查期間，蘇北淺灘N/P 平均值在48 左右，可見該比值十分適宜滸苔生長。但實驗室共培養(yǎng)結(jié)果表明石莼具有更高的生長速率，與實際海區(qū)情況相反，說明在此設(shè)置條件下營養(yǎng)鹽可能不是決定二者競爭結(jié)果的單一因子，而是滸苔組織結(jié)構(gòu)及其對光照的適應性等幾者耦合的結(jié)果。本研究證實了在營養(yǎng)鹽因子方面，黃海海域N/P 水平確實更適合滸苔的生長，這為滸苔大規(guī)模暴發(fā)提供了可能性。

圖 3 不同N/P 條件下單獨培養(yǎng)石莼的濕重（a、b）及直徑（c、d）變化Fig. 3 Changes in wet weight (a, b) and diameter (c, d) of U. lactuca under different N/P conditions of pure culture

表 2 單獨培養(yǎng)和共培養(yǎng)滸苔和石莼的相對生長速率Table 2 Relative growth rate of U. prolifera and U. lactuca under pure culture and mixed culture

表 3 石莼屬生長最適氮磷比歷史研究統(tǒng)計Table 3 Statistics on the optimum N/P for growth of Ulva

圖 4 不同N/P 條件下共培養(yǎng)滸苔的濕重和分枝長度及石莼的濕重和直徑隨時間的變化情況Fig. 4 Changes in wet weight and branch length of U. prolifera, and wet weight and diameter of U. lactuca under different N/P conditions of pure culture

5 結(jié)論

（1）滸苔單獨培養(yǎng)時，在一定范圍內(nèi)高N/P 能促進滸苔的生長，氮對于滸苔的影響大于磷。

（2）石莼單獨培養(yǎng)時，低N/P 下石莼長勢最好，但改變N/P 對石莼的影響并不顯著。

（3）滸苔和石莼共培養(yǎng)時，滸苔生長受到了一定限制，低N/P 下滸苔生長受限更顯著。

（4）蘇北淺灘海域高氮磷比值更適合滸苔的生長，可能是滸苔綠潮能夠大規(guī)模暴發(fā)的原因之一。